Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

% Umsatz
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5.9 Charakterisierung der siRNA-vermittelten target RNA-Spaltung durch hAgo2
5.9.1 Untersuchung der target RNA-Spaltung auf die Existenz einer burst
Phase
RISC bzw. Ago sind in der Lage, multiple Zyklen von Katalyse zu durchlaufen (multiple
turnover) [61, 62]. Dabei können von einem RISC mehr als 50 target RNAs gespalten werden
[63]. Auch in den hier beschriebenen Studien konnte multiple turnover unter Standard-
Spaltungsassay-Bedingungen beobachtet werden, obwohl die target RNA gegenüber der maximal
möglichen Konzentration an aktivem binären hAgo2/guide RNA-Komplexen im 40-fachen
Unterschuss vorlag (2,5 nM target RNA versus 100 nM binärer Komplex). Dabei muss jedoch
berücksichtigt werden, dass vermutlich nicht alle binären Komplexe enzymatisch aktiv sind,
da die verschiedenen Proteinpräparationen einen Teil nicht vollständig translatierter hAgo2-
Moleküle beinhaltet (siehe Abschnitt 5.4).
Wie bereits in Abschnitt 5.5.2 ausgeführt, ist die siRNA-vermittelte Spaltung von target
RNA durch hAgo2 ein ungewöhnlich langsamer Prozess. Zunächst wurde untersucht, ob unter
den gewählten Bedingungen eine Phase zu beobachten war, bei der es zu einer raschen
Zunahme von Spaltprodukten kam (burst Phase). Zu diesem Zweck wurde ein Standard-
Spaltungsassay durchgeführt und die Reaktion zu verschiedenen frühen Zeitpunkten gestoppt.
Der Umsatz wurde ermittelt und gegen die Zeit aufgetragen (siehe Abbildung 5.36).
Die Daten wurden alternativ mit Hilfe einer einfach oder zweifach exponentiellen Gleichung
ausgewertet. Für die einfach exponentielle Auswertung ergab die Geschwindigkeitskonstante
GST
hAgo2
A
40
B
40
0 1800
30
20
t (s)
target
RNA
30
20
einfach
exponentiell
zweifach
exponentiell
10
5’-Spaltprodukt
10
0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Zeit (s)
Zeit (s)
Abbildung 5.36: Kinetik der guide RNA-vermittelten Spaltungsreaktion von target RNA durch GSThAgo2
(siehe Abschnitt 4.4.1). (A) Standard-Spaltungsassay mit 3,7 µM GST-hAgo2 mit anschlieÿender
denaturierender PAGE und Detektion mittels Autoradiographie. (B) Die ermittelten Umsätze
wurden gegen die Zeit aufgetragen und mathematisch ausgewertet. Die Auswertung mittels einfach
exponentieller Gleichung ergab die Ratenkonstante k = 0,0004 (± 0,00001) s -1 mit eine Amplitude von
91,2 (± 1,8) %. Die Auswertung mittels zweifach exponentieller Gleichung ergab zwei Ratenkonstanten
k 1 = 0,0040 (± 0,0027) s -1 mit eine Amplitude von 6,4 (± 3,6) % und k 2 = 0,0003 (± 0,00004) s -1 mit
einer Amplitude von 85,1 (± 3,7) %. t: Zeit.
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