Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

gebundene siRNA (%)
gebundene siRNA (%)
5.6 Biochemische Charakterisierung von rekombinantem hTRBP
hTRBP-His-Konzentration wurden die Daten an eine quadratische Gleichung angepasst (siehe
Abbildung 5.18 D und E). Für die Bindung von hTRBP-His an si2B-FAM wurde eine
apparente Dissoziationskonstante von 120 nM ermittelt. Yamashita et al. konnten die Anität
von hTRBP für siRNA durch isothermale Titrationskalorimetrie im subnanomolaren
hTRBP
H
A
B
C
- - + + + + + -
+ + + + + + + + + + + + + + - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + +
- - - - - - - - - - - - - - - - - -
hTRBP-His
ds si2B-FAM
ss as2B-FAM
ds si2B
Aggregation
gebundene
D
100
E
100
ungebundene
degradierte
siRNA
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0 1000 2000 3000 4000
hTRBP-His (nM)
0
0 1000 2000 3000 4000
hTRBP-His (nM)
Abbildung 5.18: Untersuchungen zur Nukleinsäurebindung durch hTRBP-His mittels Gelverzögerungs-Analysen
(siehe Abschnitt 4.4.4). (A) Nicht-denaturierendes 4 20 % PAA-Gradientengel zur
Auftrennung von Ansätzen mit konstanter Konzentration uoreszenzmarkierter si2B-FAM und steigender
Konzentration von hTRBP-His. (B) Nicht-denaturierendes 4 20 % PAA-Gradientengel zur
Auftrennung von Ansätzen mit konstanter Konzentration uoreszenzmarkierter si2B-FAM sowie konstanter
Konzentration hTRBP-His mit steigender Konzentration unmarkierter kompetierender si2B.
(C) Nicht-denaturierendes 8 % PAA-Gel zur Auftrennung von Ansätzen mit konstanter Konzentration
uoreszenzmarkierter as2B-FAM und steigender Konzentration von hTRBP-His. Die Detektion
des Fluoreszenzsignals erfolgte mit Hilfe des PhosphorImagers Typhoon TM 8600. Der Anteil gebundener
si2B-FAM (D) bzw. as2B-FAM (E) wurde gegen die Konzentration von hTRBP-His aufgetragen
und die experimentellen Daten an eine quadratische Gleichung angepasst. Für si2B-FAM ergab sich
K d, app = 120 (± 45) nM. Für as2B-FAM konnte keine apparente Dissoziationskonstante ermittelt werden.
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