Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

Fluoreszenz
Fluoreszenz
5 Ergebnisse
hTRBP
H
A
9000
B
4600
8500
4400
8000
4200
7500
4000
7000
0 200 400 600 800 1000
hTRBP-His (nM)
3800
0 200 400 600 800 1000
hTRBP-His (nM)
Abbildung 5.44: Bestimmung der Afnität von hTRBP-His zu intern markierter einzelsträngiger
und doppelsträngiger siRNA (siehe Abschnitt 4.4.2). (A) Titrationskurve einer Gleichgewichts-
Fluoreszenztitration von 20 nM si2B-FAM mit steigenden Konzentrationen hTRBP-His. Die Auswertung
der Daten erfolgte mit einer quadratischen Bindungsgleichung und ergab K d = 126,8 (± 8,0) nM.
(B) Titrationskurve einer Gleichgewichts-Fluoreszenztitration von 20 nM as2B-FAM mit steigenden
Konzentrationen hTRBP-His. Die Auswertung der Daten erfolgte mit einer quadratischen Bindungsgleichung
und ergab K d > 5000 nM.
einzelsträngiger RNA keine maximale Fluoreszenzabnahme erreicht werden. Wenn man jedoch
analog zur Titration von si2B-FAM mit hTRBP-His eine Signaländerung von etwa 16 %
zugrunde legt, beträgt K d > 5000 nM (siehe Abbildung 5.44 B). Somit konnten die mittels
Gelverzögerungs-Analysen gewonnenen Daten bestätigt werden.
Wie bereits unter Abschnitt 5.6.2 ausgeführt, steht die hier beobachtete relativ geringe
Anität von hTRBP-His zu doppelsträngiger siRNA im Kontrast zu publizierten Daten, die
eine Gleichgewichts-Dissoziationskonstante im subnanomolaren Bereich beschreiben [204, 258].
Um zu untersuchen, ob die Fluoreszenzmarkierung von si2B-FAM einen Einuss auf die Bindungsreaktion
besitzt, wurde ein Komplex aus 20 nM si2B-FAM und 200 nM hTRBP-His mit
steigenden Konzentrationen si2B titriert, um eine Verdrängung zu erwirken. Zwar konnte bei
hohen Konzentrationen von si2B eine Fluoreszenzzunahme verzeichnet werden, jedoch war
die Gesamtsignaländerung zu schwach für eine verlässliche mathematische Auswertung. Deshalb
wurde alternativ die Gleichgewichts-Fluoreszenztitration mit der endständig markierten
siRNA FAM-siLam (siehe Abschnitt 3.8.2) durchgeführt, um eine Aussage über den Einuss
der Fluorophor-Position auf die Bindungsreaktion treen zu können.
Bestimmung der Anität zu endständig markierter dsRNA
Es wurden 30 nM FAM-siLam mit steigenden Konzentrationen hTRBP-His titriert und die
resultierende Fluoreszenzsignalabnahme dokumentiert. Die maximale Signalabnahme betrug
etwa 22 %. Durch Anpassung der experimentellen Daten an eine quadratische Bindungs-
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