Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.7 Charakterisierung der siRNA-Bindung durch hAgo2
guide RNA
Bezeichnung
Position des
Fluorophors
Phase 1 Phase 2 Phase 3
FAM-asLam Nukleotid 1 ja
nicht
messbar
nicht
messbar
19mer-FAM Nukleotid 6 ja ja ja
as2B-FAM Nukleotid 14 ja ja ja
sLam-Alexa488 Nukleotid 21 ja ja ja
Abbildung 5.27: Übersicht über die verwendeten guide RNAs. Dargestellt sind Bezeichnung, die Position
des Fluorophors sowie die beobachtbaren Phasen der Assoziationskinetik bei Bildung des binären
Komplexes. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurde der Phosphorylierungsstatus nicht dargestellt.
Für Sequenzen siehe Abschnitt 3.8.2.
Position des k
guide RNA
Bezeichnung
1 k 2 k 3
des Fluoreszenzsignals, die der ersten Phase zugeordnet wurde Fluorophors (siehe Abbildung (s -1 ) (s -1 ) 5.27). (s -1 ) Diese
Tatsache untermauert die Annahme, dass es sich bei der ersten Phase um die initiale
nicht nicht
Bildung
FAM-asLam Nukleotid 1
eines Kollisionskomplexes handelt, da die Kollision durch die Position der Markierung
messbar messbarnicht
beeinusst wird. Im Fall von FAM-asLam konnten die zweite und dritte Phase der Bindung
nicht beobachtet werden. Da FAM hier am 5'-Ende 19mer-FAM des guide Nukleotid Stranges 6 positioniert ist, lässt
das auf eine Interferenz zwischen FAM und der Mid Bindetasche von hAgo2 schlieÿen. Es kann
also abgeleitet werden, dass die zweite Phase dieas2B-FAM VerankerungNukleotid des 5'-Endes
14
des guide Stranges
in der Mid Bindetasche repräsentiert, die auf Grund sterischer Hinderung durch FAM nicht
stattnden kann. Weiterhin zeigt das Experiment, dass es sich bei den Phasen zwei und drei
sLam-Alexa488 Nukleotid 21
vermutlich um zwei sequentielle Ereignisse handelt, da auch die dritte Phase mit FAM-asLam
nicht beobachtet werden konnte. Mit den guide Strängen, deren Fluorophore an Position 6,
14 oder 21 positioniert sind, ndet eine Bindungsreaktion mit drei Phasen statt. Dabei sind
die Ratenkonstanten der jeweiligen Phase im Rahmen einer leichten Abweichung gleich. Also
stört eine sperrige Markierung an diesen Positionen nicht die Interaktion zwischen Protein
und Nukleinsäure. In den Fällen von 19-mer-FAM und as2B-FAM ist FAM vermutlich in der
basischen Bindungsfurche zwischen den beiden hAgo2-Lappen lokalisiert (siehe Abbildung 2.2
B), was oenbar nicht zur Interferenz führt. Im Fall von sLam-Alexa488 muss das Fluorophor
in räumliche Nähe zur PAZ Bindetasche kommen. Falls die dritte Phase der Verankerung
des 3'-Endes des guide Stranges in der PAZ Domäne entspricht, kommt es oenbar nicht zur
Interferenz zwischen Fluorophor und Protein, weil bei Verwendung dieses Substrates ebenfalls
alle drei Phasen ablaufen.
Für die guide RNA as2B-FAM konnte bereits gezeigt werden, dass die 5'-Phosphatgruppe
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