Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
zum Anderen den angestrebten Vorteil einer Entfernung unvollständig translatierter hAgo2-
Versionen nicht zeigte. Deshalb wurde für die weiteren Arbeiten das Konstrukt GST-hAgo2
ausgewählt und im präparativen Maÿstab gereinigt.
Reinigung von GST-hAgo2 im präparativen Maÿstab
Im Fall von hAgo2-His und His-hAgo2 war zwar eine Reinigung im analytischen Maÿstab erfolgreich
gewesen, die Bedingungen lieÿen sich jedoch nicht auf einen präparativen Maÿstab
übertragen und deshalb konnten keine zufriedenstellenden Ausbeuten erzielt werden (siehe
Abschnitt 5.4.1). Deshalb wurde zunächst untersucht, ob es sich im Fall von GST-hAgo2 ähnlich
verhielt. In einem semipräparativen Ansatz wurden die zuvor getesteten Bedingungen auf
ca. 3 g Zellen angewendet. Mit den Volumina von 1 ml Säulenmatrix sowie 90 ml Aufschlusspuer
wurden hierbei die Grenzen des technisch Durchführbaren im semipräparativen System
erreicht. Nach der Durchführung von Reinigung, Analyse mittels SDS-PAGE und Coomassie-
Färbung sowie Quantizierung der in den Eluaten enthaltenen Proteinmengen zeigte sich, dass
bei einer Verwendung der etwa 3,5-fachen Zellmasse gegenüber dem analytischen Maÿstab mit
1,3 mg die 2,6-fache Proteinausbeute erzielt werden konnte.
Für die sich anschlieÿende Reinigung von GST-hAgo2 im präparativen Maÿstab mit Hilfe
einer FPLC-Anlage konnten die optimierten Bedingungen aus technischen Gründen nur
näherungsweise angewendet werden. Die optimierten Puer wurden von den Experimenten
im analytischen Maÿstab übernommen. Allerdings wurden die Verhältnisse von Zellmasse zu
Aufschlusspuer- und Säulenmatrixvolumen verändert, was zu einer verbesserten oder verschlechterten
Ausbeute führen kann. Die genaue Durchführung ist unter Abschnitt 4.3.8 beschrieben.
Nach Durchführung der ersten Reinigung von GST-hAgo2 im präparativen Maÿstab zeigte
das aufgezeichnete Chromatogramm nur einen geringen Anstieg der Absorption bei 280 nm
und mit SDS-PAGE-Analyse und Coomassie-Färbung konnte nur sehr wenig GST-hAgo2 in
den Elutionsfraktionen detektiert werden (siehe Abbildung 5.10 A). Nachdem die GST-hAgo2-
enthaltende Proteinlösung das Säulenbett passiert hatte (Durchuss), wurde sie aufgefangen
und die Säule nach der ersten Elution durch Waschen mit 10 Säulenvolumina Bindungspuer
regeneriert. Anschlieÿend wurde der Durchuss ein weiteres Mal auf die Säule gepumpt, diese
wie zuvor gewaschen und die gebundenen Proteine eluiert. Bei dieser zweiten Reinigung kam
es zu einem starken Anstieg der Absorption bei 280 nm während des Elutionsvorganges. Die
anschlieÿende SDS-PAGE-Analyse und Coomassie-Färbung zeigte, dass bei der zweiten Reinigung,
im Gegensatz zur ersten, GST-hAgo2 an die Säule gebunden hatte und eluiert werden
konnte (siehe Abbildung 5.10 B). Jede weitere Wiederholung der Reinigung erzielte Proteinausbeuten,
die vergleichbar waren zur zweiten Reinigung. Der Prozess wurde insgesamt sechs
Mal durchgeführt und die GST-hAgo2 enthaltenden Elutionsfraktionen jeder Charge (1 6)
nach Abschätzung der Proteinmenge in je drei Konzentrationsgraden vereint (A: hoch kon-
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