Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4 Methoden
Es wurde für 90 min ein elektrisches Feld mit 0,8 mA/cm 2 angelegt. Die Ezienz des Elektrotransfers
wurde durch Coomassie-Färbung des SDS-Gels sowie ggf. durch Ponceau S-Färbung
der Membran kontrolliert (siehe Abschnitt 4.3.4).
Immundetektion
Für die Sättigung freier Bindungsstellen wurde die mit Proteinen beschichtete PVDF-Membran
bei Raumtemperatur in Blockpuer geschwenkt. Im Anschluss erfolgte die Inkubation
der Membran in einer die spezischen Primärantikörper enthaltenden Lösung. Zur Verringerung
des Hintergrundsignals wurde überschüssiger Primärantikörper durch Waschen entfernt.
Die Detektion der Proteine erfolgte mittels eines den Primärantikörper bindenden Sekundärantikörpers,
der mit dem Enzym Meerrettich-Peroxidase (HRP) gekoppelt ist oder durch
die direkte Kopplung des Primärantikörpers mit der HRP. Überschüssiger Sekundärantikörper
wurde durch Waschen entfernt und die Proteine indirekt durch Chemilumineszenz mit
Hilfe des Kits ECL Western Blotting Reagent nach Herstellerangaben visualisiert. Dabei katalysiert
HRP die Oxidation von Luminol und die auftretende Lumineszenz wurde entweder
durch Exposition der PVDF-Membran auf einem Hyperlm mit anschlieÿender Entwicklung
oder durch Fotograeren der Membran mit einer Chemilumineszenz-sensitiven Kamera detektiert.
Tabelle 4.9 fasst die Versuchsbedingungen für die Immundetektion der verschiedenen
Epitope zusammen. Die Zusammensetzung der Puer ist unter Abschnitt 3.6 aufgeführt.
Die Auswertung der Chemilumineszenz-Aufnahmen erfolgte mit dem Programm Fusion
15.09. Eine Quantizierung der Intensität einzelner Banden wurde bei Bedarf mit dem Programm
Image Quant 5.2 vorgenommen.
Blockierung Primärantikörper Waschen I Sekundärantikörper Waschen II
Nachweis von hAgo2
30 min 16 h, 4 ◦ C 3 × 5 min 1 h 5 × 5 min
Blockpuer I α-Ago2 (11A9) TBS-T α-Ratte-HRP TBS-T
1:50 in Block- 1:5000 in Blockpuer
I
puer I
Nachweis von hTRBP
30 min 1 h 3 × 5 min 1 h 3 × 5 min
Blockpuer II α-TRBP TBS-T α-Kaninchen-HRP TBS-T
1:2000 in Block- 1:2000 in Blockpuer
II
puer II
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