Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

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Es gelang die Isolierung einer homogenen Population NHA-hAgo2, dessen enzymatische
Aktivität bestätigt wurde (siehe Abbildungen 5.16 und 5.13). Die Zusammensetzung dieser
Population war während der Lagerung bei 4 ◦ C über mehrere Wochen stabil. Dies erönete
die Möglichkeit, den Oligomerisierungszustand von hAgo2 isoliert oder in Anwesenheit von
guide und target RNA, also während der Ausübung seiner enzymatischen Aktivität, zu beobachten.
Der hydrodynamische Radius dieser Population betrug 8 10 nm. Zunächst zeigte
sich, dass sich durch Inkubation von guide und target RNA eine Population mit gröÿerem
hydrodynamischem Radius (17 21 nm) bildete, die die in Abwesenheit von Nukleinsäuren beobachtete
kleinere Population vollständig ersetzte. Zusammen mit dem Nachweis des target
RNA-Umsatzes impliziert dies, dass diese Population Komplexe aus NHA-hAgo2, guide und
target RNA beinhaltet.
Die Stabilität von NHA-hAgo2 wurde in Abhängigkeit von der Temperatur und der Zeit
untersucht. In beiden Fällen konnte die Oligomerisierungstendenz des Proteins durch RNAs
beeinusst werden.
Die Thermostabilität des Proteins in Lösung wird durch target RNA erhöht. Die Inkubation
von NHA-hAgo führte zu einer Zunahme der durchschnittlichen Radiengröÿe mit zunehmender
Temperatur, was auf die Aggregation des Proteins hin deutet. Im Falle der Koinkubation mit
target RNA wird die durchschnittliche Radienzunahme deutlich um den Faktor 4 reduziert
(siehe Abbildung 5.17 D). Dieser Eekt wird in Anwesenheit einer komplementären guide
RNA aufgehoben, da es in diesem Fall zur Bildung spaltungsaktiver Komplexe und somit zum
slicing der target RNA kommt. Die Anwesenheit einer guide RNA allein reicht nicht aus, um
die Thermostabilität von NHA-hAgo2 zu erhöhen. Interessanterweise hebt die Anwesenheit
einer nicht-komplementären guide RNA den schützenden Eekt der target RNA ebenfalls auf,
obwohl es in diesem Fall nicht zum slicing kommt.
Bei 25 ◦ C zeigt die guide RNA einen stabilisierenden Eekt auf die enzymatisch aktive NHAhAgo2-Population
(siehe Abbildung 5.17 C). Bei der Inkubation von NHA-hAgo2 mit guide
und target RNA bleibt die Zusammensetzung der Populationen in Lösung stabil. Bei Entzug
der guide RNA ndet jedoch eine Zunahme der durchschnittlichen Radien in Abhängigkeit
der Zeit statt. Nach etwa 1 h ist hierbei eine Plateauphase erreicht. Die durchschnittliche
Radiengröÿe in An- bzw. Abwesenheit von guide RNA unterscheidet sich um den Faktor 4.
Somit wird deutlich, dass NHA-hAgo2 in Lösung durch die Anwesenheit von RNAs stabilisiert
werden kann.
6.2.2 Der Oligomerisierungszustand von hTRBP ist RNA-unabhängig
In Abschnitt 5.6.2 wurde die siRNA-Bindungseigenschaft von hTRBP-His untersucht. Dabei
zeigte sich, dass das Protein die siRNA in mehreren distinkten Komplexen bindet, die durch
Banden verschiedener elektrophoretischer Mobilität sowie groÿen Oligomeren, die die Porenweite
des Gels überschreiten, repräsentiert wird. Mittels fraktionierter Zentrifugation wurde
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