Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

Fluoreszenz
5 Ergebnisse
GST
hAgo2
6000
2,4
5000
2,38
4000
2,36
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
3000
2000
0 5000 10000 15000 20000 25000
Zeit (s)
Abbildung 5.35: Pre-steady state Dissoziationskinetik von binärem Komplex und target RNA (siehe
Abschnitt 4.4.3). Messung des Zerfalls von ternären Komplexen aus 20 nM P-as2B-FAM und 600 nM
GST-hAgo2 sowie 20 nM s2B in binäre GST-hAgo2/guide RNA-Komplexe und die freie target RNA
in Anwesenheit von 2000 nM as2B. Die Messung erfolgte mit Hilfe eines Fluoreszenzspektrometers
oder einer stopped ow Anlage (Darstellung bis 20 s). Die Daten wurden mit einer dreifach exponentiellen
Gleichung ausgewertet und ergaben k -1 = 2,1 (± 0,25) s -1 , k -2 = 0,0024 (± 0,0002) s -1 und
k -3 = 0,0003 (± 0,00006) s -1 (stopped ow) bzw. 0,0002 s -1 (Fluoreszenzspektrometer).
Die dritte, langsame Phase war nach Beendigung des maximalen Messzeitraumes (1.000 s)
nicht abgeschlossen, weshalb das Experiment wiederholt und die Fluoreszenzänderung über
einen Zeitraum von 34.000 s mit Hilfe eines Fluoreszenzspektrometers in Abhängigkeit der Zeit
aufgezeichnet wurde. Mit dieser Technik konnten auf Grund geringerer Sensitivität die ersten
beiden Phasen nicht beobachtet werden. Allerdings wurde die Existenz der dritten, langsamen
Phase mit einer Ratenkonstante von 0,0002 s -1 bestätigt. Vermutlich repräsentiert k -1
den Zerfall von Kollisionskomplexen; diejenige mittels Konzentrationsabhängigkeit von k 1, obs
mathematisch ermittelte Ratenkonstante beträgt 11,8 s -1 . Die zweite und dritte Phase bei der
Dissoziation ternärer Komplexe entsprechen vermutlich konformationellen Umlagerungen und
stellen die Rückreaktionen der Phasen zwei und drei der Assoziation dar. Da die dritte Phase
nur in Anwesenheit von GST-hAgo2, nicht jedoch bei seiner Abwesenheit, auftritt, handelt
es sich hierbei aller Wahrscheinlichkeit nach um eine konformationelle Umlagerung des Proteins.
Die zweite Phase könnte die Entwindung der komplementären guide und target Stränge
darstellen. Es wurde eine mögliche Dissoziation von guide und target RNA in Abwesenheit
von GST-hAgo2 untersucht, jedoch konnte keine Signaländerung festgestellt werden. Demnach
handelt es sich beim hier beobachteten Zerfall ternärer Komplexe um einen proteinvermittelten
Prozess.
Die Interpretation der biochemischen und kinetischen Daten wird gestützt durch die strukturellen
Informationen des T. thermophilus Agos sowie weiteren biochemischen Daten aus der
Literatur. Die Erkennung der target RNA durch den binären Komplex erfolgt vermutlich über
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