Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
Bereich bestimmen [204]. Chakravarthy et al. ermittelten Dissoziationskonstanten mittels Filterbindungsexperimenten,
die ebenfalls im subnanomolaren Bereich lagen [258]. Da bei den
verwendeten Methoden auf eine Markierung des Substrates verzichtet werden kann, liegt der
Schluss nahe, dass die Fluoreszenzmarkierung in den hier durchgeführten Experimenten einen
Einuss auf die Bindung besitzt. Für die Bindung einzelsträngiger guide RNA lässt sich kein
eindeutiger Wert angeben. Allerdings kann man näherungsweise davon ausgehen, dass der K d
mindestens 50 × gröÿer ist.
Die gezeigten Daten lassen den Schluss zu, dass mit dem etablierten Reinigungsprotokoll
(siehe Abschnitt 5.4.3) korrekt gefaltetes hTRBP-His gewonnen wurde, das für funktionelle
Studien eingesetzt werden kann.
5.6.3 Studien zum Oligomerisierungsverhalten von hTRBP-His
Die Gelverzögerungs-Analysen zeigten, dass hTRBP-His in verschiedenen multimeren Zuständen
Komplexe mit siRNA bildet. Dabei traten vor allem groÿe Komplexe auf, die nicht ins Gel
einwandern konnten. Im Folgenden wurde das Oligomerisierungsverhalten von hTRBP-His in
Lösung näher untersucht. Dabei wurde auch der Einuss einer siRNA auf die Bildung groÿer
Multimere hinterfragt.
Untersuchung mittels analytischer Gelltration
Für diese Untersuchungen wurden Experimente, wie unter Abschnitt 4.4.5 beschrieben, durchgeführt.
Mit Hilfe einer Eichgeraden, die durch Verwendung eines Gelltrationsstandards erstellt
worden war (siehe Abschnitt 5.4.1), konnten die erwarteten Retentionszeiten für hTRBP-
His-Monomere, -Dimere und -Tetramere berechnet werden (siehe Abbildung 5.19 A).
Zunächst wurden 152 µg hTRBP-His auf die Superdex 200 HR10/30 Gelltrationssäule geladen
und die Absorption bei 260 nm und 280 nm in Abhängigkeit der Zeit aufgezeichnet. Das
Chromatogramm zeigt eine prominente Absorptionsänderung bei t R = 16,2 min (siehe Abbildung
5.19 B). Wie bereits unter Abschnitt 5.5.5 ausgeführt, repräsentiert dieses Absorptionsmaximum
aller Wahrscheinlichkeit nach Multimere mit einem Molekulargewicht von über
1.300 kDa, also mindestens 30 hTRBP-His-Moleküle des Molekulargewichts 40,4 kDa. Die Positionen,
an denen mono-, di- bzw. tetrameres Protein basierend auf den Berechnungen mit der
Eichgeraden von der Säule eluieren würde, sind dargestellt. Durch eine Kontrolle mit dem Lagerpuer
von hTRBP-His konnte das Absorptionsmaximum D als von einem Puerbestandteil
verursacht zugeordnet werden.
Die Eluate wurden in Fraktionen gesammelt und mittels SDS-PAGE analysiert. Um auch
hTRBP-His geringerer Konzentration durch Coomassie-Färbung detektieren zu können, wurden
die Fraktionen mit Absorptionsmaxima kleiner 0,02 relativen Einheiten zuvor quantitativ
durch TCA gefällt. In den Fraktionen A, B und C konnte hTRBP-His nachgewiesen werden,
wobei die Höhe der Absorptionsmaxima mit der Intensität der Proteinbanden korreliert. Die
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