Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4 Methoden
Protein Temperatur der Hauptkultur Induktionszeit
NHA-hAgo2 37 ◦ C 2 h
hAgo2-His 37 ◦ C 2 h
His-hAgo2 37 ◦ C 1 4 h
GST-hAgo2-His 17 37 ◦ C 1 6 h
GST-hAgo2 17 37 ◦ C 1 6 h
TRBP 37 ◦ C 1 4 h
Tabelle 4.10: Versuchsbedingungen für die Expression verschiedener Proteine.
4.3.7 Fraktionierung von bakteriellem E. coli Extrakt
Um die Expression von bakteriell exprimiertem rekombinantem Protein zu überprüfen und
zu untersuchen, ob dies in löslicher oder unlöslicher Form in den E. coli Zellen vorlag, wurde
ein Extrakt von Zellen vor und nach Induktion hergestellt. Die Untersuchung von Proben
verschiedener Zeitpunkte nach Induktion erlaubte weiterhin die Analyse der Expressionsstärke
sowie die Verteilung von löslichem und unlöslichem Protein in Abhängigkeit der Induktionszeit.
Es wurden E. coli Zellen, in denen zuvor die Expression von rekombinantem Protein induziert
worden war (siehe Abschnitt 4.3.6) im jeweiligen Lysispuer (siehe Abschnitt 4.3.8)
resuspendiert und auf eine Konzentration von 0,05 OD 600 pro 10 µl eingestellt. Die Suspension
wurde soniziert und das Gesamtzelllysat für 15 min bei 4 ◦ C und 20.000 × g zentrifugiert.
Der die löslichen Proteine enthaltende Überstand wurde für die spätere Analyse verwahrt,
der Niederschlag in 200 µl 10 mM Tris pH 7,5 gewaschen, für 5 min bei 4 ◦ C und 20.000 × g
zentrifugiert und im adäquaten Volumen 1 % (w/v) SDS unter Erwärmen auf 55 ◦ C gelöst.
Die im Gesamtzelllysat sowie der löslichen und unlöslichen Fraktion enthaltenen Proteine wurden
elektrophoretisch separiert (siehe Abschnitt 4.3.3) und durch Coomassie-Färbung (siehe
Abschnitt 4.3.4) oder Western-Analyse (siehe Abschnitt 4.3.5) untersucht.
4.3.8 Reinigung von rekombinanten Proteinen
Es war ein zentrales Ziel dieser Arbeit, ein leistungsfähiges und reproduzierbares Reinigungssystem
für rekombinantes hAgo2 zu entwickeln, mit dem im Milligramm-Maÿstab und mit
zufriedenstellender Reinheit Protein für biochemische Studien gewonnen werden konnte. Für
diesen Zweck wurde hAgo2 mit fünf verschiedenen Markierungen verwendet, die je nach Eigenschaft
unterschiedliche Reinigungsstrategien erlaubten. Die Entwicklung der einzelnen Protokolle
ist unter Abschnitt 5.4 beschrieben. An dieser Stelle sind die Protokolle aufgeführt,
die sich für das jeweilige Konstrukt als am leistungsfähigsten unter den angegebenen Gesichtspunkten
erwiesen haben. Soweit möglich, erfolgten alle Arbeitsschritte zur Schonung der
Proteine auf Eis oder bei 4 ◦ C.
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