Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6.3 Charakterisierung der siRNA-vermittelten target RNA-Spaltung durch hAgo2
die Verteilung von verschiedenen Proteinpopulationen analysiert (siehe Abschnitt 5.6.3). Anhand
dieser Daten zeigte sich, dass etwa 75 % von hTRBP-His in Komplexen vorliegen, deren
Radius gröÿer als 50 nm ist. Oligomere Strukturen dieser Gröÿenordnung sind auf Grund ihrer
Gröÿe nicht in der Lage, in ein nicht-denaturierendes Gel einzuwandern, wie es im Fall der
Gelverzögerungs-Analysen verwendet wurde. Diese Spezies ist deshalb vermutlich identisch
mit derjenigen, die sich bei den Gelverzögerungs-Analysen innerhalb der Geltaschen bendet.
Gredell et al. beschrieben in Gelverzögerungs-Analysen ebenfalls das Phänomen mehrerer
distinkter Banden, und postulierten, dass es sich bei den verschiedenen Banden um siRNAbindende
Mono-, Di- und Tetramere handeln könnte [237]. Durch eine Zentrifugation für 1 h
bei 4 ◦ C und 150.000 × g wurden diejenigen Proteinpopulationen isoliert, deren Radien weniger
als 50 nm betrugen und anhand von Dynamischer Lichtstreuung analysiert (siehe Abschnitt
5.6.3). Es wurden zwei Populationen detektiert, die auf Grund ihrer Molekülradien vermutlich
Mono- bis Dimere sowie Di- bis Tetramere enthalten. Dieses Ergebnis ist konsistent mit den
Arbeiten von Gredell et al. und den Daten der Gelverzögerungs-Analysen dieser Arbeit.
In einem weiteren experimentellen Ansatz wurde eine Gröÿenausschlusschromatographie
von hTRBP-His in An- und Abwesenheit von siRNA durchgeführt (siehe Abschnitt 5.6.3). In
Abwesenheit von siRNA konnte gezeigt werden, dass hTRBP nur zu einem geringen Teil in
mono- bis tetramerer Form vorliegt. Der weitaus gröÿere Teil eluierte in Proteinkomplexen,
die mindestens 30 Moleküle umfassten. Nach Beladung von hTRBP-His mit siRNA wurde eine
weitere Gröÿenausschlusschromatographie durchgeführt und beide Chromatogramme verglichen.
Die Bindung der siRNA zeigte dabei keinen Einuss auf die Verteilung der mono- bis
oligomeren Strukturen. Dieses Ergebnis ist konsistent mit den Daten der Gelverzögerungs-
Analysen (siehe Abschnitt 5.6.2).
Die Ergebnisse von Gelverzögerungs-Analysen, fraktionierter Zentrifugation, DLS und Gröÿenausschlusschromatographie
geben einen ersten Einblick in das komplexe Oligomerisierungsverhalten
von hTRBP. In Kombination implizieren die gezeigten Daten, dass das Protein
parallel in monomerem, dimerem, oligomerem und aggregiertem Zustand in Lösung vorliegt.
Dabei ist ein Einuss der Proteinkonzentration denkbar [204]. Interessanterweise scheint die
Bindung von siRNA mehrheitlich unabhängig von der Gröÿe der Proteinkomplexe zu sein.
6.3 Charakterisierung der siRNA-vermittelten target
RNA-Spaltung durch hAgo2
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Wirkungsweise der zentralen Komponente des humanen
RISC, hAgo2, detailliert untersucht. Zu diesem Zweck wurde die siRNA-abhängige Spaltung
von target RNA in Teilreaktionen untergliedert und diese individuell charakterisiert. Dazu
gehören die Bindung des guide Stranges, die Erkennung und Bindung der target RNA, ihre
Spaltung und die Freisetzung der gespaltenen Fragmente aus dem ternären Komplex (siehe
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