åêðáéäåõóçó γ.ν.α.
åêðáéäåõóçó γ.ν.α.
åêðáéäåõóçó γ.ν.α.
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΑ ΧΡΟΝΙΚΑ, ΤΟΜΟΣ 71, ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ, 2009<br />
451<br />
η ανίχνευση γνωστών σημειακών πολυμορφισμών<br />
αποτελεί τη συχνότερη μέθοδο επιλογής.<br />
Επί της αρχής, δύο προσεγγίσεις με PCR είναι<br />
δυνατές:<br />
α. PCR με τη χρήση εκκινητών ειδικών στο 3΄ άκρο<br />
τους ως προς το πολυμορφικό νουκλεοτίδιο (SSP-PCR).<br />
Η μέθοδος είναι γνωστή και ως ενίσχυση με τη χρήση<br />
εκκινητών ειδικών για την αλληλουχία (allele specific<br />
primer amplification-ASPA) 9,10,11<br />
β. Ενίσχυση ολόκληρης της περιοχής που περιλαμβάνει<br />
το νουκλεοτιδικό πολυμορφισμό (SNP) με<br />
τη βοήθεια κατάλληλων εκκινητών 9,12<br />
α. SSP- PCR 9<br />
Η μέθοδος αυτή χαρακτηρίζεται από υψηλή ευαισθησία<br />
και είναι γρήγορη στην εφαρμογή. Το μεγαλύτερο<br />
μειονέκτημά της είναι ότι δεν είναι πάντα<br />
δυνατόν να σχεδιαστούν τελείως συμπληρωματικοί<br />
εκκινητές ως προς την αλληλουχία ενώ είναι εφικτό<br />
αλλά επίπονο σαν διαδικασία να πραγματοποιηθούν<br />
ταυτόχρονα πολλαπλές PCR στο ίδιο σωληνάριο (ταυτόχρονος<br />
έλεγχος για διαφορετικές θέσεις του ίδιου ή<br />
διαφορετικών αλληλομόρφων - multiplex PCR).<br />
1. Η πιο απλή προσέγγιση για την ανίχνευση του<br />
προϊόντος της PCR είναι η ηλεκτροφόρηση σε<br />
γέλη όπου τα προϊόντα διαχωρίζονται με βάση το<br />
μέγεθός τους. Το μέγεθος του προϊόντος της PCR<br />
χρησιμεύει σαν ένα επιπλέον control.<br />
2. Η ανίχνευση των προϊόντων μπορεί να γίνει και<br />
με τη μέθοδο ELISA, στην περίπτωση αυτή όμως<br />
δεν υπάρχει η δυνατότητα ελέγχου του μεγέθους<br />
του προϊόντος.<br />
3. Η άμεση ανίχνευση του προϊόντος της PCR η οποία<br />
βασίζεται στο φθορισμό είναι ένα κλειστό σύστημα<br />
και συνήθως χρησιμοποιείται σε συνδυασμό<br />
με PCR πραγματικού χρόνου (real-time PCR). Η<br />
τεχνική αυτή είναι κατάλληλη για τυποποιήσεις<br />
μεγάλου αριθμού δειγμάτων για πολλές διαφορετικές<br />
γενετικές θέσεις. Η ανίχνευση με βάση το<br />
φθορισμό μπορεί να γίνει με τη μέθοδο TaqMan,<br />
FRET, molecular beacon, SYBRGreen (αποτελούν<br />
διαφορετικές μορφές φθοριζόντων ιχνηθετών) .<br />
β. Ενίσχυση όλης της περιοχής<br />
που περιλαμβάνει το SNP 9,10,12<br />
Πολλές τεχνικές γονοτύπησης βασίζονται σε αυτή<br />
την προσέγγιση καθώς η δημιουργία μιας τέτοιας<br />
PCR είναι πιο εύκολη και επιπλέον είναι πιο εύκολο<br />
να πραγματοποιηθεί multiplex PCR. Η προσέγγιση<br />
αυτή είναι κατάλληλη για ταυτόχρονη γονοτύπηση<br />
πολλών διαφορετικών συστημάτων ομάδων<br />
αίματος.<br />
1. Ανίχνευση με υβριδοποίηση σε ειδικούς ιχνηθέτες.<br />
Σε ένα κλειστό σύστημα οι ίδιοι φθορίζοντες ιχνηθέτες<br />
που αναφέρονται παραπάνω μπορούν να<br />
χρησιμοποιηθούν μόνο που σε αυτή την κατηγορία<br />
ο νουκλεοτιδικός πολυμορφισμός τοποθετείται<br />
κυρίως στη μέση του ιχνηθέτη. Η ειδικότητα μπορεί<br />
να αυξηθεί με τη δημιουργία καμπυλών τήξης.<br />
Για τις διάφορες προσεγγίσεις υπάρχουν ειδικά<br />
softwares. Μία από τις πιθανές εφαρμογές είναι<br />
και αυτή των μικροσυστοιχιών στην οποία πολλοί<br />
διαφορετικοί ειδικοί ιχνηθέτες προσδένονται<br />
σταθερά πάνω σε διάφορες επιφάνειες π.χ γυαλί<br />
(αναλυέται παρακάτω).<br />
2. Μέθοδοι μικρής έκτασης προσδιορισμού της αλληλουχίας<br />
του DNA (minisequencing).<br />
Η αρχή της μεθόδου είναι ότι στις περισσότερες<br />
περιπτώσεις προστίθεται στο προϊόν της PCR<br />
ένας κοινός εκκινητής, σε συνέχεια της θέσης του<br />
νουκλεοτιδικού πολυμορφισμού,. Η επιμήκυνση<br />
του εκκινητή είναι διαφορετική για τα διαφορετικά<br />
αλληλόμορφα. Κάτι τέτοιο μπορεί να ανιχνευτεί με<br />
διάφορες τεχνικές όπως με την επιμήκυνση κατά<br />
μία βάση (single base extension – SBE) κατά την<br />
οποία ο εκκινητής επιμηκύνεται με φθορίζοντα<br />
νουκλεοτίδια ή τη μέθοδο του pyrosequencing κατά<br />
την οποία μετριέται χημειοφωταύγεια κατά την<br />
απελευθέρωση πυροφωσφορικού.<br />
Οι τεχνικές αυτές είναι κατάλληλες για γονοτύπηση<br />
μεγάλου αριθμού δοτών για περιορισμένο αριθμό<br />
συστημάτων ομάδων αίματος.<br />
3. PCR σε συνδυασμό με κατεργασία με ένζυμα περιορισμού<br />
(PCR-RFLP). Η πέψη του προϊόντος της<br />
PCR με ένζυμα περιορισμού και η ανάλυση των<br />
τμημάτων διαφορετικού μήκους που προκύπτουν,<br />
με ηλεκτοφόρηση, μπορεί να αποκαλύψει νουκλεοτιδικούς<br />
πολυμορφισμούς στις θέσεις δράσης των<br />
ενζύμων.<br />
4. Αλυσιδωτή αντίδραση λιγάσης (oligonucleotide ligase<br />
assay-OLA). Η αλυσιδωτή αντίδραση λιγάσης περιλαμβάνει<br />
κυκλική, εξαρτώμενη από την αλληλουχία<br />
ένωση δύο ολιγονουκλεοτιδίων και συχνά χρησιμοποιείται<br />
σαν δεύτερο βήμα μετά την ενίσχυση<br />
με PCR. Ο συνδυασμός ενός ολιγονουκλεοτιδίου<br />
σημασμένου με βιοτίνη με ένα ολιγονουκλεοτίδιο<br />
σημασμένο με διγοξυγενίνη επιτρέπει την ανίχνευση<br />
του προϊόντος με ELISA. Εναλλακτικά πραγματοποιείται<br />
πρώτα η αλυσιδωτή αντίδραση λιγάσης και<br />
στη συνέχεια PCR που ακολουθείται με ανάλυση<br />
των προϊόντων με capillary ηλεκτροφόρηση.
Change language