åêðáéäåõóçó γ.ν.α.
åêðáéäåõóçó γ.ν.α.
åêðáéäåõóçó γ.ν.α.
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
452 Τυποποίηση αδιευκρίνιστων ομάδων με μοριακό έλεγχο<br />
Β. ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΓΝΩΣΤΩΝ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΩΝ<br />
ΚΑΙ ΑΛΛΗΛΟΜΟΡΦΩΝ ΠΟΥ ΔΕΝ ΟΦΕΙΛΟΝΤΑΙ<br />
ΣΕ ΣΗΜΕΙΑΚΕΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ<br />
Όλες οι μέθοδοι που προαναφέρθηκαν στοχεύουν<br />
στην ανίχνευση διακριτών γνωστών πολυμορφισμών<br />
και πολύ σπάνια θα ανιχνεύσουν άλλες διαταραχές<br />
της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας κατά τύχη. Αρκετές<br />
τεχνικές δεν έχουν σαν στόχο συγκεκριμένους νουκλεοτιδικούς<br />
πολυμορφισμούς αντίθετα επιτρέπουν τον<br />
έλεγχο εκτενέστερων παραλλαγών της νουκλεοτιδικής<br />
αλληλουχίας. Έτσι, για παράδειγμα, σποραδικές, χωρίς<br />
νόημα, μεταλλάξεις μπορεί να μην διαφύγουν της<br />
ανίχνευσης, κάτι το οποίο αυξάνει την ειδικότητα του<br />
τεστ. Αυτές οι επιπλέον πληροφορίες θα πρέπει να<br />
αξιολογηθούν σε σχέση με την αυξανόμενη πολυπλοκότητα<br />
των τεχνικών αυτών. Επιπλέον η εφαρμογή<br />
τους στη ρουτίνα μπορεί να περιπλέξει τα πράγματα<br />
με την ανίχνευση συχνών, εντούτοις κλινικά μη σημαντικών,<br />
σιωπηρών μεταλλάξεων ή μεταλλάξεων σε<br />
εσώνια. Οι πιο συχνά εφαρμοζόμενες τεχνικές αυτής<br />
της κατηγορίας είναι οι ακόλουθες 10,12 :<br />
1. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή με κλίση αποδιατακτικού<br />
(Denaturating Gradient Gel Electrophoresis-DGGE)<br />
Στην DGGE τα δίκλωνα προϊόντα της PCR ηλεκτροφορούνται<br />
σε μία κλίση αποδιατακτικού μέσου<br />
αυξανόμενης συγκέντρωσης. Σε κάποια χαρακτηριστική<br />
συγκέντρωση, τμήμα του δίκλωνου DNA αρχίζει<br />
να αποδιατάσσεται κάτι το οποίο συνεπάγεται<br />
ελάττωση της κινητικότητας και χαρακτηριστική<br />
της αλληλουχίας θέση. Η ηλεκτροφόρηση διαρκεί<br />
συνήθως 24 ώρες και οι συνθήκες του μέσου πρέπει<br />
να έχουν προσεκτικά προσαρμοστεί στα χαρακτηριστικά<br />
του ηλεκτροφορούμενου προϊόντος.<br />
2. Ανάλυση ετεροδιμερών (heteroduplex analysis).<br />
Ετεροδιμερή που περιέχουν λάθος ταίριασμα σε<br />
μία μόνο βάση μπορούν να διαχωριστούν από<br />
ομοδιμερή ή άλλα ετεροδιμερή με ηλεκτροφόρηση<br />
σε gel χωρίς τη χρήση αποδιατακτικού μέσου. Τεχνητά<br />
τμήματα DNA με μικρές ελλείψεις μπορούν<br />
να προκαλέσουν την εμφάνιση ετεροδιμερών σχεδόν<br />
για κάθε αλληλόμορφο.<br />
3. Προσδιορισμός της αλληλουχίας του DNA (sequencing).<br />
Αποτελεί τη πιο αποτελεσματική μέθοδο για<br />
την ανάλυση μιας επιθυμητής αλληλουχίας και<br />
η αυτοματοποίησή της την έχει κάνει λιγότερο<br />
επίπονη και πλέον προσιτή.<br />
Γ. ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣ ΤΟΥ ΜΕΛΛΟΝΤΟΣ: BIOCHIPS<br />
Παρόλο που όλες οι προαναφερθείσες τεχνικές<br />
συντέλεσαν σημαντικά στην πρόοδο για την ανίχνευση<br />
και ταυτοποίηση διαφόρων αλληλομόρφων, αποτελούν<br />
μέθοδο επιλογής για έλεγχο μικρού αριθμού<br />
δειγμάτων και για περιορισμένα συστήματα ομάδων<br />
αίματος κάθε φορά. Κάτι τέτοιο είναι αποτέλεσμα της<br />
πολυπλοκότητας, του μεγάλου χρόνου και κόπου που<br />
απαιτούν και του γεγονότος ότι έχουν μικρή απόδοση<br />
καθώς κάθε έλεγχος που πραγματοποιείται αφορά<br />
ξεχωριστά στο κάθε δείγμα. 13<br />
Σημαντικές εξελίξεις έχουν επιτευχθεί στην προσπάθεια<br />
ανάπτυξης τεχνικών μεγάλης απόδοσης στη<br />
μοριακή γονοτύπηση ομάδων αίματος, κυρίως με την<br />
εισαγωγή των μικροσυστοιχιών. 14<br />
Κάθε μικροσυστοιχία αποτελείται από μια συλλογή<br />
μικροποσοτήτων ιχνηθετών που βρίσκονται μόνιμα<br />
προσδεμένοι σε σταθερή επιφάνεια (π.χ γυαλί) και οι<br />
οποίοι είναι συμπληρωματικοί ως προς τις επιθυμητές<br />
αλληλουχίες DNA που έχουν πολλαπλασιαστεί με<br />
τη χρήση κατάλληλων εκκινητών και multiplex PCR.<br />
Tα προϊόντα της PCR έχουν σημανθεί κατάλληλα με<br />
φθορίζουσες χρωστικές οι οποίες θα επιτρέψουν την<br />
μέτρηση σήματος στις θέσεις στις οποίες θα πραγματοποιηθεί<br />
υβριδοποίηση με τους συμπληρωματικούς<br />
ιχνηθέτες, κατόπιν επώασης. Τα τελικά αποτελέσματα<br />
λαμβάνονται με τη χρήση ειδικών σαρωτών που<br />
αναλύουν την εικόνα και μετρούν τον φθορισμό ενώ<br />
ειδικά υπολογιστικά προγράμματα μετατρέπουν τα<br />
λαμβανόμενα σήματα σε τελικά αποτελέσματα (π.χ<br />
συγκεκριμένοι γονότυποι για τα διάφορα συστήματα<br />
ομάδων αίματος που ελέγχονται). 15<br />
Οι δύο πιο ολοκληρωμένες εφαρμογές μικροσυστοιχιών<br />
σχετικά με τα αντιγόνα των ομάδων αίματος<br />
είναι το Bloodchip 14 , αποτέλεσμα του προγράμματος<br />
BloodGen, το οποίο έχει τη δυνατότητα ανίχνευσης 106<br />
SNPs σε αλληλόμορφα των συστημάτων ABO, RHD,<br />
RHCE, KEL, FY, JK, DI, CO, MNS, DO και το σύστημα<br />
Beadchip 13,16 στο οποίο μπορεί να γίνει ανίχνευση<br />
διαφορετικών αλληλομόρφων των συστημάτων RH,<br />
KEL, FY, DO, MNS, JK, LU, DI, LW, CO, SC καθώς και<br />
της HbS 13 . Χαρακτηριστικό της εξαιρετικά μεγάλης<br />
απόδοσης αυτών των τεχνικών είναι το γεγονός πως<br />
το σύστημα Beadchip μπορέι να τυποποιήσει 96 δείγματα<br />
DNA σε περίπου 4 ώρες!<br />
Εύκολα μπορεί κάποιος να αντιληφθεί πως οι<br />
παραπάνω τεχνολογίες δεν αποτελούν μέθοδο επιλογής<br />
για μεμονωμένα δείγματα στα οποία παρουσιάζεται<br />
πρόβλημα σαφούς καθορισμού φαινότυπου<br />
με τον ορολογικό προσδιορισμό, αλλά έρχονται να<br />
υποστηρίξουν μία νέα τάση στη μετάγγιση αίματος<br />
που ζητά πλήρη γονοτυπικό προσδιορισμό τόσο του<br />
ασθενή που πρόκειται να μεταγγιστεί όσο και κάθε<br />
μονάδας αίματος που «εισέρχεται» στο εργαστήριο<br />
της Αιμοδοσίας προκειμένου να επιτυγχάνεται αν όχι
Change language