3. Uluslararası Beyaz Et Kongresi

yönteminde hedef DNA dizisinin her ucuna özgü spesifik primerler kullanılarak termostabil
DNA polimeraz yardımıyla uygulanan PCR çeşidir. Denatürasyon, bağlanma ve uzama olmak
üzere üç temel aşamadan oluşur (24).
Restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (RFLP–PCR) yönteminde ise, polimeraz zincir
reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılmış DNA bölgesinin restriksiyon enzimleri ile kesimine dayanan
RFLP-PCR yöntemi türler arasında ayrımın yapılmasında kullanılan yöntemlerden biridir.
Özellikle mitokondrial DNA’nın hedef kontrol bölgelerinin analizine dayanan PCR-RFLP
yöntemi et karışımlarında tür ayrımının yapılmasında geniş oranda kullanılmaktadır (25,26).
PCR-RFLP, tür tespitinde, türe-spesifik primerlere dayalı yöntemlerden de daha iyi olmasına
rağmen bazı olumsuzlukları vardır (27). Primerler, analiz edilecek tüm türlerin mitokondrial
DNA’sına tümüyle uymayabilir (4,28). Tür ayrımında tespiti sağlayacak olan diagnostik alanların
türler arasında değişkenlik göstermediğinin doğrulanması gerekmektedir (28).
Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA yöntemi (RAPD), nükleotid dizilimi rastgele seçilmiş
primerler kullanılarak yapılan bir polimeraz zincir reaksiyonu olup, nükleotid dizi bilgisine
sahip olmaksızın çoğalımın belirlenmesini sağlayan bir yöntemdir. Bu yöntemde; bilinen özgün
bir DNA bölgesini çoğaltmak yerine, rastgele seçilen bir veya daha fazla primer kullanarak
DNA’daki birçok bölgenin çoğaltılması gerçekleştirilir. DNA parmak izi olarak da adlandırılan
RAPD’in temeli, yaklaşık 10 nükleotidlik ve nükleotid dizilimi rastgele seçilmiş tek çeşit
primerin kullanımına dayanmaktadır.Bu yöntemin başlıca avantajları, spesifik PCR ve RFLP
yöntemlerindeki gibi her hayvan için türe spesifik primerlerin kullanılmasına ve her hayvan türü
için ayrı bir PCR işlemine gerek duyulmamasıdır. Ayrıca türlerin DNA dizilişlerinin bilinmesine
de gerek yoktur. Bu avantajlar sayesinde RADP yöntemiyle et türlerinin tespiti daha kısa sürede
ve daha ucuz olarak yapılmaktadır (29). Bu yöntemin dezavantajları ise; farklı primerler ile farklı
sonuçlar alınması ve aynı tür içersinde, tekrarlar arasında küçük varyasyonlar oluşabilmesidir
(22).
Real time PCR ile et ürünlerinde tür miktar oranının tespiti dört aşamadan oluşmaktadır. Bu
aşamalar; numune homojenizasyonu, numuneden DNA’nın ekstrakte edilmesi, master miks
hazırlama, real time PCR prosesi ve değerlendirme aşamasıdır (30). Et ve et ürünlerinde tür
tayini ya da et ürünü içerisinde yüzde olarak ne kadar et türü bulunduğunu polimeraz zincir
reaksiyonu ile saptayabilmek için DNA molekülünün saf bir şekilde elde edilmesi gerekir
(31). Et ürünlerinden izole edilen DNA’nın miktarının belirlenebilmesi için hazırlanmış olan
master mix ve DNA real time PCR’da belirlenmiş olan sıcaklık programında proses edilir. Real
time PCR genel olarak denatürasyon, primerin bağlanması ve uzama aşaması olmak üzere üç
basamaktan oluşur.
Multiplex PCR yönteminde ise birden fazla primer çifti kullanarak, tek reaksiyonda birçok hedef
bölgenin aynı anda çoğaltılması ve her bir primer çiftine özgü, farklı büyüklükteki amplifikasyon
ürünlerinin agoroz jelde veya real time PCR cihazında gözlenmesidir (32).
Multiplex PCR; klasik veya real time PCR’ın modifikasyonuyla iki veya daha fazla farklı PCR
çoğalımının aynı reaksiyonda gerçekleştirilmesine dayanır. Klasik PCR ile aynı basamaklarda
gerçekleşir fakat her bir reaksiyonda çoklu primer setleri kullanılır. Multiplex PCR ile daha
az zamanda daha çok hedef bölge çoğaltımı gerçekleştirildiğinden kullanışlı bir yöntemidir.
Değişik hedef bölgelerinin aynı reaksiyon şartlarında çoğaltılmasını sağlamak için kullanılacak
595