Abbas 8ed - Imunologia Celular e Molecular

para o antígeno microbiano (p. ex., anticorpos reativos com proteínas do vírus da
imunodeficiência humana [HIV] ou vírus da hepatite B) como indicadores da infecção.
Nestes casos, uma quantidade saturante de antígeno é adicionada para poços
replicados e contendo anticorpo ligado, ou o antígeno é adicionado diretamente na
placa, e diluições seriadas do soro do paciente são então adicionadas. A quantidade
de anticorpo do paciente que se liga ao antígeno imobilizado é determinada pelo uso
de um anticorpo anti-imunoglobulina (Ig) humana ligado à enzima ou radiomarcado.
Identificação e Purificação de Proteínas
Anticorpos podem ser usados para identificar e caracterizar proteínas e para purificar
proteínas específicas em misturas. Dois métodos comumente utilizados para identificar
e purificar proteínas são a imunoprecipitação e a cromatografia por imunoafinidade. O
Western blotting é uma técnica amplamente utilizada para determinar a presença e o
tamanho de uma proteína em uma amostra biológica.
Imunoprecipitação e Cromatografia por Imunoafinidade
A imunoprecipitação é uma técnica na qual um anticorpo específico para um antígeno
proteico em uma mistura de proteínas é usado para identificar este antígeno
específico (Fig. A-2, A). O anticorpo é tipicamente adicionado à mistura de proteína
(normalmente um lisado detergente de células específicas), e uma proteína A
estafilocócica (ou proteína G) covalentemente ligada a partículas de agarose é
adicionada na mistura. As porções Fab do anticorpo se ligam às proteínas-alvo, e a
porção Fc do anticorpo é capturada pela proteína A ou proteína G nas partículas.
Proteínas indesejadas que não se ligam ao anticorpo são, então, removidas com
lavagens das partículas (por adição repetitiva de detergente e centrifugação). A
proteína específica que é reconhecida e agora ligada ao anticorpo pode ser eluída
das partículas e dissociada do anticorpo com o uso de uma solução desnaturante
(p. ex., sódio dodecil sulfato) e as proteínas são separadas por eletroforese em gel de
poliacrilamida-sódio dodecil sulfato (SDS-PAGE). As proteínas podem ser detectadas
após a eletroforese com coloração do gel de poliacrilamida com um corante de
proteína ou com análise do Western blot (descrito mais adiante). Se a mistura original
contiver proteínas marcadas radioativamente, as proteínas específicas
imunoprecipitadas pelo anticorpo podem ser reveladas por autofluorografia ou
autorradiografia, com as bandas proteicas sendo capturadas em um filme de raios X
colocado no gel SDS-poliacrilamida seco e contendo as proteínas separadas.