Abbas 8ed - Imunologia Celular e Molecular

são mencionados em muitos capítulos deste livro. Transgenes também podem ser
expressos sob controle de elementos promotores que respondem a fármacos e
hormônios, tais como a tetraciclina e os estrogênios. Nestes casos, a transcrição do
transgene pode ser controlada à vontade pela administração do agente indutor.
Um método poderoso para o desenvolvimento de modelos animais de distúrbios
em um único gene, e a maneira mais definitiva para estabelecer a função de um gene
in vivo, é a criação de camundongos knockout com mutação ou rompimento
direcionado de um gene. Esta técnica se baseia no fenômeno da recombinação
homóloga. Se um gene exógeno é inserido em uma célula, por exemplo, por
eletroporação, ele pode se integrar randomicamente dentro do cromossoma da
célula. Entretanto, se o gene contiver sequências que são homólogas a um gene
endógeno, ele irá se recombinar preferencialmente e substituir sequências
endógenas. Para selecionar células que passaram por recombinação homóloga,
uma estratégia de seleção baseada em um fármaco é utilizada. O fragmento de DNA
homólogo a ser inserido na célula é colocado em um vetor que contém tipicamente o
gene de resistência a neomicina e um gene viral de timidina quinase (tk) (Fig. A-6, A).
Este vetor-alvo é construído de tal forma que o gene de resistência à neomicina
sempre é inserido dentro do DNA cromossômico, mas o gene tk é perdido sempre
que ocorrer uma recombinação homóloga (em oposição à inserção randômica). Este
vetor é introduzido nas células, e as células são postas a crescer em neomicina e
ganciclovir, um fármaco que é metabolizado pela timidina quinase para gerar um
produto letal. As células nas quais o gene está integrado randomicamente serão
resistentes à neomicina, mas serão mortas pelo ganciclovir, ao passo que as células
nas quais a recombinação homóloga tiver ocorrido serão resistentes a ambos os
fármacos porque o gene tk não será incorporado. Esta seleção positiva-negativa
garante que o gene inserido nas células sobreviventes passará por recombinação
homóloga com sequências endógenas. A presença do DNA inserido no meio de um
gene endógeno normalmente rompe as sequências de codificação e anula a
expressão ou função daquele gene. Além disso, vetores-alvo podem ser designados
de maneira que a recombinação homóloga venha a levar à deleção de um ou mais
éxons do gene endógeno.