Abbas 8ed - Imunologia Celular e Molecular

A cromatografia por imunoafinidade, uma variante da cromatografia por afinidade, é
um método de purificação que se baseia nos anticorpos ligados a um suporte
insolúvel para purificar antígenos a partir da solução (Fig. A-2, B). Anticorpos
específicos para um antígeno desejado são tipicamente ligados covalentemente a um
suporte sólido, tais como partículas de agarose, e empacotados dentro de uma
coluna. Uma complexa mistura de antígenos é passada através das partículas para
permitir que o antígeno que é reconhecido pelo anticorpo possa se ligar. Moléculas
não ligadas são lavadas, e o antígeno ligado é eluído com a troca do pH ou pela
exposição de muito sal ou outras condições caotróficas que quebram as interações
antígeno-anticorpo. Um método similar pode ser usado para purificar anticorpos de
sobrenadantes de culturas ou fluidos naturais, tais como soro, primeiramente com
ligação do antígeno às partículas e passagem dos sobrenadantes ou soro.
Western blotting
O Western blotting (Fig. A-3) é usado para identificar e determinar a quantidade
relativa e o peso molecular de uma proteína dentro de uma mistura de proteínas ou
outras moléculas. A mistura é primeiramente submetida à separação analítica,
tipicamente por SDS-PAGE, de tal forma que as posições finais de diferentes proteínas
no gel ocorrem em função de seus tamanhos moleculares. A matriz de proteínas
separadas é, então, transferida do gel de separação de poliacrilamida para um
suporte de membrana por eletroforese, de maneira que a membrana adquire uma
réplica do padrão das macromoléculas separadas e presentes no gel. O SDS é
deslocado da proteína durante o processo de transferência, e os determinantes
antigênicos nativos são frequentemente recuperados como dobras das proteínas. A
posição do antígeno proteico na membrana pode, então, ser detectada com a ligação
de um anticorpo não marcado específico para aquela proteína (o anticorpo primário)
seguido por um anticorpo secundário marcado e que se liga ao anticorpo primário.
Este procedimento fornece informações sobre o tamanho do antígeno e sua
quantidade. Em geral, os marcadores dos anticorpos secundários são marcados
com enzimas que geram sinais de quimioluminescência e deixam imagens em filme
fotográfico. Fluoróforos de infravermelho também podem ser usados para marcar os
anticorpos, e a luz produzida pela excitação do fluoróforo fornece uma quantificação
do anticorpo mais apurada quando comparado com anticorpos secundários ligados
à enzima. A sensibilidade e especificidade desta técnica podem ser aumentadas com
uso de proteínas imunoprecipitadas em vez de misturas de proteínas brutas. Este
procedimento sequencial é especialmente útil para a detecção de interações
proteína-proteína. Por exemplo, a associação física de duas proteínas diferentes na
membrana de um linfócito pode ser estabelecida pela imunoprecipitação de um
extrato de membrana com uso de um anticorpo específico para uma das proteínas e
marcação do Western blot do imunoprecipitado utilizando um anticorpo específico