Abbas 8ed - Imunologia Celular e Molecular

ecombinase irá mediar a deleção do gene-alvo. Ambas as sequências de gene
normal e de gene de resistência à neomicina serão deletadas. Ressalta-se que a
expressão do gene cre, e assim a deleção do gene-alvo, pode ser restrita a certos
tecidos ou tempos especificados com o uso de construções de transgene cre com
diferentes promotores. Por exemplo, a deleção seletiva de um gene somente em
macrófagos e granulócitos pode ser acompanhada pelo uso de camundongo
transgênico em cre no qual cre é direcionado pelo promotor lisozima, ou a perda
seletiva de um gene somente nas células T regulatórias pode ser acompanhada
usando o promotor foxp3 que direciona o transgene cre. Alternativamente, um
promotor induzido por esteroide pode ser usado de forma que a expressão de Cre e
subsequente deleção do gene ocorram somente após os camundongos receberem
uma dose de dexametasona. Muitas outras variações nesta tecnologia foram
desenvolvidas para criar mutantes condicionais. A tecnologia Cre/loxP também pode
ser usada para criar camundongos knockin. Neste caso, os locais loxP são
colocados no vetor-alvo para flanquear o gene de resistência à neomicina e as
sequências homólogas, mas eles não flanqueiam a substituição (knockin) de
sequências de genes. Dessa maneira, após a deleção mediada por cre, o gene
exógeno permanece no genoma no local alvo.
A tecnologia de gene knock in tem sido aplicada para criar camundongos
“repórteres” nos quais as células que normalmente expressariam uma proteína em
particular expressam uma molécula fluorescente no mesmo local de uma proteína
nativa. Isso é realizado com a substituição do gene nativo por um transgene que
codifica uma proteína repórter fluorescente e a proteína nativa, ambas sob o controle
do promotor e amplificador nativos. Os camundongos “repórteres” foram
desenvolvidos para permitir a visualização de células imunes de subgrupos
particulares in vivo, tais como camundongos nos quais as células Th17 produtoras de
IL-17 também expressam uma proteína fluorescente. Estas células podem ser
detectadas utilizando-se microscópio de fluorescência intravital. As células que
expressam os genes “repórteres” também podem ser isoladas vivas e submetidas a
estudos funcionais ex vivo, mesmo que o gene “repórter” nativo seja um fator de
transcrição nuclear cuja expressão poderia ser somente detectável por métodos que
matam as células. Por exemplo, células T regulatórias vivas podem ser isoladas por
FACS a partir de linfonodos de um camundongo “repórter” que expressa a proteína
verde fluorescente simultaneamente com o fator de transcrição FoxP3.
Uma nova abordagem para gerar mutações nas linhagens celulares, assim como
nas células ES, utiliza uma modificação do sistema de defesa bacteriano contra DNA
estranho denominada sistema CRISPR (repetições palindrômicas curtas de
interespaços regularmente agrupados, do inglês clustered regularly interspaced
short palindromic repeats) Cas9 (nuclease 9 associada a CRISPR). Na variação da
edição do gene, um guia de RNA hibridiza com uma sequência de DNA alvo
escolhida e permite que a Cas9 nuclease gere uma quebra da fita dupla escolhida.