Abbas 8ed - Imunologia Celular e Molecular

ou enzima e a posição do marcador, determinada com um microscópio apropriado, é
usada para inferir a posição do antígeno. Na versão mais antiga deste método,
chamada de imunofluorescência, o anticorpo era marcado com um corante
fluorescente e incubado para se ligar a uma monocamada de células ou a uma
seção congelada de tecido. As células ou tecidos corados eram examinados com um
microscópio de fluorescência para localizar o anticorpo. Embora sensível, o
microscópio de fluorescência não é uma ferramenta ideal para a identificação de
estruturas celulares ou teciduais detalhadas em virtude de uma baixa razão sinalruído.
Este problema tem sido superado com novas tecnologias, incluindo a
microscopia confocal, que utiliza tecnologia de seccionamento ótico para filtrar a luz
fluorescente não focalizada; e o microscópio de dois fótons, que impede que se forme
luz fora de foco. Alternativamente, anticorpos podem ser acoplados a enzimas que
convertem substratos incolores a substâncias coloridas insolúveis que precipitam na
posição da enzima. Um microscópio de luz convencional pode, então, ser utilizado
para localizar o anticorpo em uma célula ou tecido corados. A variante mais comum
deste método utiliza a enzima horseradish peroxidase, e o método é comumente
nomeado como técnica da imunoperoxidase. Outra enzima comumente utilizada é a
fosfatase alcalina. Diferentes anticorpos acoplados a diferentes enzimas podem ser
utilizados em conjunto para produzir localizações simultâneas com duas cores para
distintos anticorpos. Em outras variações, o anticorpo pode ser acoplado a um
marcador eletrodenso, como ouro coloidal, e a localização do anticorpo pode ser
determinada subcelularmente com o uso de um microscópio eletrônico, uma técnica
denominada microscopia imunoeletrônica. Partículas de ouro de diferentes tamanhos
têm sido usadas para a localização simultânea de diferentes antígenos em níveis
ultraestruturais.
Em todos os métodos imunomicroscópicos, sinais podem ser aumentados com o
uso de técnicas de sanduíche. Por exemplo, em vez de se ligar a horseradish
peroxidase a um anticorpo específico de camundongo direcionado contra o antígeno
de interesse, ele pode ser ligado a um segundo antianticorpo (p. ex., anticorpo Ig de
coelho contra camundongo) que é utilizado para se ligar ao primeiro anticorpo
marcado. Quando o marcador é ligado diretamente ao anticorpo primário específico,
o método é dito como sendo direto; quando o marcador é ligado a um anticorpo
secundário ou mesmo terciário, o método é dito como sendo indireto. Em alguns
casos, moléculas diferentes do anticorpo podem ser usadas nos métodos indiretos.
Por exemplo, a proteína A estafilocócica, que se liga à IgG, ou avidina, que se liga aos
anticorpos primários marcados com biotina, podem ser acopladas a fluorocromo ou
enzimas.
Medida de Interações Antígeno-Anticorpo
Em muitas situações, é importante conhecer a afinidade de um anticorpo pelo