Abbas 8ed - Imunologia Celular e Molecular

ecombinação homóloga. O gene de timidina quinase (tk) no
vetor será inserido no genoma somente se ocorrer
recombinação randômica não homóloga. B, As células ES
que foram transfectadas pelo vetor-alvo são selecionadas por
neomicina e ganciclovir, de maneira que somente aquelas
células com a inserção-alvo (recombinação homóloga)
sobrevivem. Estas células são então inseridas em
blastocistos, que são implantados no útero de fêmea de
camundongo pseudográvida. Um camundongo quimérico se
desenvolverá de tal forma que alguns tecidos serão derivados
das células ES que carreiam a mutação-alvo no gene X.
Estes camundongos quiméricos são identificados por uma
mistura de cores, incluindo a cor dos camundongos dos
quais as células ES foram derivadas e a cor da linhagem dos
camundongos dos quais o blastocisto foi derivado. Se a
mutação estiver presente nas células germinativas, ela pode
ser propagada nas linhadas subsequentes.
Para gerar um camundongo que carreie um gene-alvo rompido ou mutado, um
vetor-alvo é usado para primeiro romper o gene em uma linhagem de célula-tronco
embrionária murina (ES). As células ES são células pluripotentes derivadas de
embriões de camundongo que podem ser propagadas e induzidas a se diferenciar
em cultura ou que podem ser incorporadas em um blastocisto de camundongo, o
qual pode ser implantado em uma mãe pseudográvida que o geste a termo.
Resssalta-se que a progênie das células ES se desenvolverá normalmente em
tecidos maduros que expressarão os genes endógenos que foram transfectados
para as células ES. Assim, o vetor-alvo designado para romper um gene em particular
é inserido nas células ES, e colônias nas quais a recombinação homóloga ocorreu
(em um cromossoma) são selecionadas com fármacos, como descrito anteriormente
(Fig. A-6, B). A presença da recombinação desejada é verificada pela análise do DNA
com técnicas como hidribização por Southern blot ou reação em cadeia da
polimerase. As células ES selecionadas são injetadas em blastocistos, que são
implantados em fêmeas pseudográvidas. Os camundongos que se desenvolvem
serão quiméricos para a quebra ou mutação heterozigótica, ou seja, alguns dos
tecidos serão derivados das células ES e outros do blastocisto normal remanescente.
As células germinativas normalmente também são quiméricas, mas pelo fato de
serem haploides, somente algumas conterão a cópia do cromossoma com o gene
rompido (mutado). Se os camundongos quiméricos forem mantidos juntos com
animais normais (selvagens) e o esperma, ou óvulos, contendo o cromossoma se
fundir com o parceiro selvagem, todas as células da descendência derivada de tal
zigoto serão heterozigóticas para a mutação (a chamada transmissão da linha