PROCEDIMENTOS E NORMAS PARA EXPORTAÇÕES DE PRODUTOS LÁCTEOS - G100

CGAL - Coordenação Geral de Apoio Laboratorial
CONTAGEM DE Clostridium SULFITO REDUTORES E DE Clostridium perfringens
Gerador de anaerobiose;
Reagentes para coloração de Gram.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra
Pesar 25 ± 0,2 g da amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V,
“Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras”, deste Manual.
Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1% e homogeneizar por
aproximadamente 60 segundos em “stomacher”. Essa é a diluição 10 -1 .
5.2 Procedimentos de controle
Aplicar os procedimentos de controle especíÞ cos estabelecidos pelo laboratório.
5.3 Inoculação em Placas
A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas de acordo com o Anexo
II, “Diluições e soluções”, deste Manual.
A partir das diluições escolhidas, semear alíquotas de 1 mL em placas estéreis e
adicionar cerca de 15 mL de ágar TSC ou SFP em temperatura de 46 - 48ºC.
Homogeneizar cuidadosamente e deixar solidiÞ car em superfície plana.
Após, adicionar uma segunda camada de cerca de 10 mL do mesmo meio.
Deixar solidiÞ car em superfície plana.
5.4 Incubação
Imediatamente após a solidiÞ cação do ágar, incubar as placas (sem inverter), em jarra
de anaerobiose a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.
5.5 Seleção e Isolamento
As colônias típicas de Clostridium sulÞ to redutores são negras e de tamanho variável
de 1 a 3 mm no ágar TSC e no ágar SFP.
Selecionar placas que contenham entre 20 e 200 colônias típicas.
Contar todas as colônias negras presentes. Anotar o resultado.
Esse resultado, multiplicado pela diluição usada, corresponde ao número de
Clostridium sulÞ to redutores presentes por grama da amostra em análise.
Escolher 5 colônias negras e repicar para tubos com ágar estoque. Incubar em
anaerobiose a 36 ± 1ºC por no mínimo 24 horas. Paralelamente, repicar para meio
tioglicolato ou caldo de carne cozida (com selo estéril de vaspar ou vaselina ou
paraÞ na líquida ou óleo mineral).
5.6 Testes conÞ rmativos para Clostridium perfringens
5.6.1 Coloração de Gram
A partir de cultura pura em ágar estoque ou dos meios usados paralelamente,
preparar esfregaço e corar pelo método de Gram. Quando for veriÞ cada a presença
de bastonetes retos com extremidades arredondadas, Gram-positivos, realizar a prova
de fermentação tempestuosa.
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