PROCEDIMENTOS E NORMAS PARA EXPORTAÇÕES DE PRODUTOS LÁCTEOS - G100

Procedimentos e Normas para Exportações de Produtos Lácteos
PESQUISA DE Paenibacillus larvae subsp. Larvae
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer metodologia analítica para a detecção de Paenibacillus larvae subsp.
larvae (referido no restante do texto como P. larvae), agente da enfermidade Cria
Pútrida Americana. A metodologia destina-se à veriÞ cação da presença de esporos do
agente em amostras de produtos da colméia.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Preparo da Amostra
O aquecimento da amostra a 45ºC visa diminuir a viscosidade, permitir a distribuição
homogênea dos esporos e facilitar a manipulação. A diluição com solução salina
tamponada, além de viabilizar a concentração dos esporos pela centrifugação que
se segue, contribui para bloquear parcialmente a ação inibidora de crescimento
bacteriano, exercida por substâncias presentes no mel.
2.2 Centrifugação
Visa concentrar os esporos presentes na amostra por meio de centrifugação a 3.000
x g por 30 minutos (g = 0, 0000118 x raio do rotor (cm) x rpm 2 )
2.3 Choque Térmico
Por meio do aquecimento, a 80ºC por 10 min., do sedimento da amostra obtido por
centrifugação, obtém-se a eliminação das formas vegetativas de bactérias que podem
interferir no crescimento de Paenibacillus larvae e diÞ cultar a seleção de colônias.
2.4 Isolamento e Seleção
Baseia-se na semeadura sobre a superfície seca de ágar Paenibacillus larvae (ABL),
meio composto por ágar estoque, ágar soja triptona, ágar Cereus (PEMBA) - base,
suplementado com emulsão de gema de ovo, ácido nalidíxico e ácido pipemídico. A
emulsão de gema de ovo promove a multiplicação de P.larvae e permite a diferenciação
de microrganismos pela reação da lecitinase. A presença de 0,1% de peptona, associada
ao piruvato de sódio (presentes no PEMBA), evidencia a precipitação da lecitina da
gema do ovo, provocada por espécies de Bacillus que possuem essa propriedade. O
manitol, carboidrato presente no meio, não é fermentado pelo Paenibacillus larvae.
O indicador de pH presente no meio é o azul de bromotimol. O ácido nalidíxico atua
inibindo total ou parcialmente o crescimento de P. alvei, B. megaterium, P.larvae
subsp. pulvifaciens, P. polymyxa e B. pumilus. O ácido pipemídico atua prevenindo
o crescimento de B. circulans, B. subtilis, B. licheniformis, B. cereus, B. mycoides,
P.larvae subsp. pulvifaciens e P. apiarius.
2.5 Provas conÞ rmativas
Baseiam-se na observação das características morfológicas e tintoriais; na observação
da capacidade de decompor a caseína; na incapacidade de produzir catalase; no
crescimento escasso em ágar nutriente isento de extrato de levedura e no crescimento
típico no ágar leite com tiamina (ALT).
458 G-100
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DAS PEQUENAS E MÉDIAS
COOPERATIVAS E EMPRESAS DE LATICÍNIOS