PROCEDIMENTOS E NORMAS PARA EXPORTAÇÕES DE PRODUTOS LÁCTEOS - G100

CGAL - Coordenação Geral de Apoio Laboratorial
PESQUISA DE Escherichia coli O157:H7
PESQUISA DE Escherichia coli O157:H7
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento analítico para a pesquisa de Escherichia coli O157:H7 em
alimentos e água.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Enriquecimento seletivo
Baseia-se na incubação de 25 ± 0,2 g ou mL da amostra em solução salina peptonada
tamponada adicionada de vancomicina, ceÞ xime e cefsulodin (SPT-VCC), por 6 horas
em temperatura de 36 ± 1ºC.
O efeito seletivo é exercido pela associação de vancomicina, ceÞ xime e cefsulodin, que
visa à inibição da ß ora acompanhante, especialmente Proteus sp e Aeromonas sp.
2.2 Separação imunomagnética
Baseia-se em duas ações principais: a captura por ligação imunológica e a separação
por ação de forças magnéticas. A aplicação dessas duas ações leva à obtenção de
efeitos de concentração e puriÞ cação do microrganismo-alvo.
O sistema de separação imunomagnética utiliza microesferas superparamagnéticas
cobertas uniformemente com uma Þ na camada polimérica, biologicamente inerte, que
protege o material magnético e oferece uma área de superfície deÞ nida para adsorsão
ou acoplamento de várias moléculas onde estão ligados anticorpos policlonais antiE.coli
O157. Na língua inglesa, estas microesferas são denominadas de “beads”.
2.2.1 Lavagem das microesferas
Baseia-se em três passos de lavagem com solução salina tamponada, adicionada de
tween 20, realizados com a Þ nalidade de retirar microrganismos inespeciÞ camente
ligados às partículas imunomagnéticas.
2.3 Isolamento
Baseia-se na semeadura da alíquota imunomagneticamente separada sobre a superfície
seca de ágar MacConkey Sorbitol (MCS), o que permite que as células aderidas às
microesferas formem colônias.
Normalmente mais de uma célula se adere a cada partícula imunomagnética, o que
pode resultar em colônias originárias de mais do que uma célula aderida.
No ágar MCS, o efeito seletivo é exercido pelos sais biliares e pelo cristal violeta
presentes no meio, que atuam inibindo a ß ora Gram positiva. A fermentação do sorbitol
é evidenciada pela viragem da cor do indicador de pH (vermelho neutro) para vermelho
intenso.
2.4 IdentiÞ cação bioquímica
Baseia-se na inoculação das culturas suspeitas em uma bateria miniaturizada de
testes padronizados. Os microtubos, contendo substratos desidratados para cada
teste, são reidratados pela adição da suspensão do microrganismo teste em diluente
especíÞ co para esta Þ nalidade.
Durante a incubação a 36 ± 1ºC, devido ao metabolismo bacteriano, ocorrem mudanças
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