30845 Suppl Giot.pdf - Giornale Italiano di Ortopedia e Traumatologia

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G.I.O.T. 2010;36(suppl. 1):S154-S157 Scaffold 3D a confronto per la rigenerazione ossea con aDSC (Adipose Derived Stem Cells) G. Gastaldi * ** , L. Visai ** **** , B. Conti ** ***** , E. Saino ** **** , a. asti ** *** , r. Dorati ** ***** ** *** , F. Benazzo rIaSSuNTO Background: per la riparazione delle lesioni ossee il trattamento d’elezione è rappresentato dal trapianto autologo di tessuto osseo. L’ingegneria tissutale si occupa di costruire del tessuto osseo ingegnerizzato per ricreare la continuità della struttura scheletrica in modo da facilitare il processo naturale di rigenerazione ossea. Obiettivi: questo studio ha confrontato 3 diversi tipi di scaffold (di titanio trabecolare, di acido polilattico-co-glicolide e di polilatticoco-glicolide con idrossiapatite) come supporto per la crescita e la differenziazione in senso osteogenico di cellule staminali. Metodi: le cellule staminali derivate da tessuto adiposo sottocutaneo (ADSC) sono state seminate sugli scaffold, differenziate in senso osteogenico e il loro differenziamento valutato con miscroscopia a scansione e tecniche di biologia molecolare e biochimiche. Risultati: le ADSC si differenziavano su tutti i tipi di scaffold provati secernendo una grande quantità di matrice extracellulare nella quale era presente l’enzima fosfatasi alcalina che è un marker specifico del differenziamento in senso osteogenico. Conclusioni: gli scaffold di titanio trabecolare e di acido polilattico-co-glicolide puro o miscelato ad idrossiapatite sono validi supporti per l’ingegneria tissutale. Le ADSC sono una popolazione di cellule con elevata potenzialità per la medicina riparativa anche in campo ortopedico. Parole chiave: cellule staminali umane di tessuto adiposo, differenziazione ossea, ingegneria tissutale SuMMary Background: the elective treatment of surgical bone repair is the autologous graft. Engineered bone tissue to recreate the continuity of damaged skeletal segments is one of the field of interest of tissue engineering. Purposes: in this investigation we compare 3 different scaffolds (Trabecular titanium, poliactic/co/glicolide acid, and polilactic/co/ glicolide acid with hydroxyapatite) as support for growth and differentiation of stem cells toward osteogenesis. * Dipartimento di Fisiologia, Università di Pavia; ** Centro di Ingegneria Tissutale (C.I.T.), Università di Pavia; *** Clinica Ortopedica e Traumatologica, Fondazione IRCCS San Matteo, Università di Pavia; **** Dipartimento di Biochimica, Università di Pavia; ***** Dipartimento di Chimica Farmaceutica, Università di Pavia. Indirizzo per la corrispondenza: Francesco Benazzo, Clinica Ortopedica, IRCCS San Matteo, P.le Golgi 2, 27100 Pavia. E-mail: fbenazzo@unipv.it S154 The adipose tissue derived stem cells (ADSC) were seeded on the scaffolds, differentiated versus osteogenesis. The differentiation was proved with SEM, and molecular biology and biochemical techniques. Results: the ADSC differentiated on all kind of scaffolds with a production of a big amount of extracellular matrix. The alkaline phoshatase was present as a marker of the differentiation toward the osteogenetic pattern. Conclusions: trabecular titanium as well as the PLA scaffolds, both pure or hydroxypatatite coated are valid supports for tissue engineering. The ADSC are a population of powerful cells to be adopted in the riparative and rigenerative medicine in the orthopaedic field. Keywords: ADSC, bone differentiation, tissue engineering INTrODuzIONE Il trattamento di lesioni ossee di dimensioni critiche dovute a traumi, tumori, osteoporosi può essere problematica a causa della elevata specializzazione del tessuto osseo e della complessità dei segnali che ne regolano lo sviluppo. L’innesto di tessuto osseo autologo è la scelta di elezione, ma non sempre è perseguibile a causa della scarsità di tessuto osseo che si può ottenere. Pertanto c’è grande interesse verso la produzione di tessuto osso ingegnerizzato. Le cellule staminali in vivo sono le cellule responsabili della riparazione dei tessuti danneggiati: esse hanno capacità chemio tattica 1 , secernono fattori paracrini in grado di far regredire una insufficienza d’organo acuta 2 e sono in grado di moltiplicarsi e differenziarsi in diversi tipi cellulari come adipociti, condrociti, osteoblasti. In vitro mantengono queste capacità e quando sono fatte crescere in presenza di opportuni terreni di differenziamento possono formare nuovo tessuto. Le cellule staminali mesenchimali sono cellule adulte che si possono ottenere da tessuti come il midollo osseo, la polpa dentaria, il periostio, il liquido amniotico, il tessuto adiposo. Tra le cellule staminali mesenchimali di grande interesse sono le cellule ottenute dal tessuto adiposo sottocutaneo per la quasi totale mancanza di morbilità nella sede del prelievo e per la disponibilità di un grande numero di cellule autologhe dopo pochi giorni di coltura. La costruzione di tessuto osseo ingegnerizzato necessita di due componenti fondamentali: uno scaffold tridimesionale biocompatibile e osteoinduttivo e una popolazione di cellule con elevata capacità di proliferare e di produrre tessuto osseo. Lo scaffold serve come supporto meccanico su cui le cellule possono aderire, proliferare e differenziarsi per formare il nuovo tessuto in presenza dei fattori di differenziamento. Lo scaffold può essere fatto con differenti tipi di materiali come titanio, idrossiapatite, acido polilattico, poliuretano. In campo ortopedico, alcuni di questi materiali sono già utilizzati
con grande successo nel trattamento di difetti ossei e fratture in forma di placche, viti, spaziatori, chiodi. Il titanio trabecolare ha una elevata biocompatibilità, ha il vantaggio di avere una grande resistenza meccanica e quindi, utilizzato come scaffold, di poter sopportare forze elevate anche prima che si sia formato nuovo tessuto osseo. Gli scaffold polimerici invece hanno la caratteristica di essere impianti transitori perchè riassorbibili e di poter veicolare fattori bioattivi necessari alla crescita di nuovo tessuto osseo come le BMP. Essi inoltre hanno caratteristiche meccaniche (resistenza alla compressione e rigidità) simili a quelle del tessuto ospite finchè non sono sostituiti dal nuovo tessuto osseo. Durante il processo di biodegradazione si formano monomeri come acido lattico e acido glicolico che sono facilmente eliminabili dalle cellule seguendo le normali vie cataboliche e quindi non si accumulano nell’organismo e non risultano tossici. Scopo di questa ricerca è di valutare con tecniche di microscopia elettronica, di biologia molecolare e di biochimica la biocompatibilità di tre diversi tipi di scaffold, uno costituito da titanio trabecolare, uno da acido polilattico-co-glicolide (PLGA) e un altro da acido polilattico-co-glicolide miscelato a idrossiapatite (PLGA/HA) e inoltre la capacità delle cellule staminali di tessuto adiposo di aderire, proliferare e differenziare in senso osteogenico su questi scaffold per poter essere utilizzate con successo per la riparazione di tessuto osseo danneggiato. MaTErIaLI E METODI Le ADSC sono state ottenute da tessuto adiposo sottocutaneo umano per digestione enzimatica con collagenasi di tipo II per 1 h a 37°C in bagno termostatato agitante secondo Gastaldi et al. 3 . Le ADSC ottenute erano sospese in terreno DMEM F12-HAM contenente FBS 10%, penicillina/streptomicina 100 U e anfotericina [terreno di crescita] e lasciate crescere fino a raggiungere una confluenza del 90% in termostato in presenza di CO 2 al 5% a 37°C. Il terreno era cambiato due volte la settimana. Le cellule aderenti erano quindi tripsinizzate e 1 x 10 5 ADSC per 100 mm 2 erano seminate in fiasche con lo stesso terreno di crescita. Questo passaggio era ripetuto tre volte. La presenza o assenza dei marker di superficie CD73, CD90 e CD45 delle cellule ottenute era valutata con citofluorimetria a flusso. Semina sugli scaffold Al terzo passaggio 4.5 x 10 5 cellule tripsinizzate erano seminate sugli scaffold posti in multi-well e lasciati aderire alla struttura per 2 h in termostato prima dell’aggiunta di 3 ml di terreno di crescita. Per indurre il differenziamento osteogenico, dopo 7 giorni dalla semina sugli scaffold, il terreno di crescita era sostituito da DMEM F12-HAM contenente FBS 15%, beta-glicerofosfato 10 mM, desametazone 100nM, acido ascorbico 0.05 mM, antibiotici e anfotericina (terreno osteogenico) per tutto il periodo di coltura. Scaffold Gli scaffold di titanio trabecolare erano forniti dalla ditta Lima-Lto S.p.A. (Lima, Villanova di San Daniele del Friuli, Italia); avevano G. Gastaldi, et al. una porosità del 65% con un diametro dei pori di 640 μm. Gli scaffold di PLGA e PLGA/HA erano preparati con il metodo di Dorati et al. 4 utilizzando una soluzione di PLGA (15% w/v in 1,4-Dioxano) e una sospensione di idrossiapatite 5% in PLGA. Come porogeno erano utilizzate particelle di NaCl con diametro di 600-1180 µm. La porosità degli scaffold di PLGA era 84% e quella degli scaffold di PLGA/HA era 75%, il diametro dei pori era compreso tra 300 e 350 µm. Tutti gli scaffold avevano una altezza di 6 mm e un diametro di 12 mm. Microscopia elettronica a scansione La microscopia elettronica a scansione era eseguita sui tre diversi tipi di scaffold su cui erano fatte crescere e differenziare le ADSC per 21 giorni seguendo il metodo descritto da Gastaldi et al. 3 . Attività della fosfatasi alcalina, marker del differenziamento osseo L’attività della fosfatasi alcalina era valutata nelle cellule seminate sugli scaffold di titanio trabecolare e coltivate in terreno di crescita e osteogenico per 21 giorni. Il lisato cellulare era incubato a 37°C per 30 min in tampone glicina 50 mM, MgSO 4 1 mM, ZnSO 4 1 mM , pH 10.5, contenente p-nitrofenil-fosfato 5 mM. La reazione era bloccata con l’aggiunta di NaOH 1 N e l’assorbanza del p-nitro-fenolo formato letta a 410 nm. L’attività enzimatica era espressa come µmol p-fenilfosfato idrolizzato/mg proteine ∙ min. La concentrazione delle proteine del lisato cellulare era valutata col metodo di Lowry et al. 5 Isolamento del RNA totale e real-time PCR L’RNA totale era estratto dalle cellule cresciute sugli scaffold di titanio trabecolare in presenza e assenza di terreno osteogenico per 7, 14 e 21 giorni con il reagente QIAzol (Qiagen SpA, Milano, Italia). La reazione di trascrizione inversa del mRNA a cDNA era ottenuta con random esameri e l’enzima Trascrittasi M-MLV (Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.). La PCR quantitativa (qPCR) era eseguita in triplicato con 1 µl di cDNA e con i primer specifici della fosfatasi alcalina (for: AGC CCT TCA CTG CCA TCC TGT; rev: ATT CTC TCG TTC ACC GCC CAC) secondo il metodo di Laforenza et al. 6 . La qPCR era normalizzata usando come gene housekeeping GUSB (QT 00046046 QuantiTect Primer Assay, Qiagen) e i risultati erano espressi come fold change rispetto al valore a 7 giorni di coltura. Estrazione delle proteine della matrice extracellulare Al termine del periodo di coltura le proteine secrete dalle ADSC negli scaffold erano estratte e la quantità di fosfatasi alcalina presente dosata con metodo ELISA 3 . rISuLTaTI L’analisi al citofluorimetro mostrava che le ADSC erano positive per i marker di superficie CD73 e CD90 (tipici delle cellule staminali mesenchimali) e negative per il marker CD45 (marker delle cellule della linea ematopoietica) in accordo con i dati di letteratura (Fig. 1) 7 . Lo studio al microscopio elettronico a scansione mostrava che le ADSC coltivate e differenziate per 21 giorni sui tre diversi tipi di scaffold erano in grado di proliferare e produrre una abbon- S155
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