30845 Suppl Giot.pdf - Giornale Italiano di Ortopedia e Traumatologia

fossero presenti gli elementi cellulari e molecolari più importanti
della rigenerazione. La qualità di un “prodotto” per uso rigenerativo
è sempre legata alle sue caratteristiche biologiche come
composizione, concentrazioni cellulari e molecolari, status di
attivazione. Per questo motivo si è cercato di dimostrare che le
caratteristiche biologiche del CLP attive nella rigenerazione sono,
entro certi limiti, prevedibili, standardizzabili e sicure, e permettono
di delimitare i confini entro cui il CLP secondo i parametri
di qualità noti dalla letteratura, risulta terapeuticamente efficace.
Parallelamente si è voluto dimostrare che il CLP è un emocomponente
non assimilabile ad un farmaco, poiché generato con tecniche
di “manipolazione minima” come specificato dal Regolamento CE
n. 1394/2007. Distinzione questa essenziale per la collocazione
normativa dell’emocomponente proposto, che vincola il suo utilizzo
e la diffusa fruibilità.
MaTErIaLI E METODI
La produzione dell’emocomponente ad uso rigenerativo proposto
prevede l’utilizzo di un separatore cellulare Haemonetics
MCS+ (Haemonetics Corp., Braintree, MA, USA), un circuito
per la raccolta delle cellule staminali periferiche e un protocollo
di separazione modificato. Alla fine del prelievo, si ottengono in
sacche separate due emocomponenti intermedi, plasma e CLP. Il
CLP viene arricchito successivamente, di proteine (fibrinogeno,
fibronectina) contenute nella frazione insolubile del crioprecipitato
ottenuto dal plasma raccolto. Se necessario (applicazioni ripetute
nel tempo), il CLP arricchito di crioprecipitato può essere frazionato
sterilmente in più aliquote e crioconservato per un anno previa
aggiunta di un criopreservante che mantiene la vitalità cellulare.
Il CLP per essere efficace terapeuticamente sulle lesioni, deve
essere attivato. L’attivazione viene indotta con trombina autologa,
ottenuta dallo stesso paziente, che determina la formazione di una
matrice di fibrina nelle cui maglie rimangono bloccate le cellule e
le piastrine attivate. L’emocomponente, in forma di gel, può essere
applicato sulla lesione per semplice apposizione includendo o meno
tessuto osseo, oppure per infiltrazione nella compagine del tessuto
come nel caso di lesioni tendinee, legamenti e dei dischi intervertebrali.
In alcuni specifici casi motivi tecnico-operativi impongono
una consistenza del “prodotto” molto superiore a quella del gel,
che permetta al chirurgo di modellare, far aderire e se necessario
suturare il “prodotto” attivato sulla lesione, ma soprattutto operare
endoscopicamente in siti come le cavità articolari. Proprio per
soddisfare questa esigenza, in collaborazione con il Dipartimento
di Medicina Trasfusionale, è stata recentemente implementata una
procedura per produrre dal gel leuco-piastrinico una membrana
F. Biggi, et al.
leuco-fibrino-piastrinica applicabile ad esempio in lesioni cartilaginee
articolari di natura degenerativa e/o post-traumatica. La
membrana, costituita dalle componenti cellulari e molecolari che
normalmente intervengono nella rigenerazione, viene prodotta
senza manipolazioni estensive e senza apertura del sistema, ma in
perfetta continuità con la produzione del gel, mediante semplici
processi di centrifugazione in sistema chiuso.
rISuLTaTI
In sintesi i risultati dei conteggi sugli emocomponenti studiati (45
procedure) dimostrano un incremento di concentrazione per tutte le
tipologie cellulari, con i più alti fattori di arricchimento proprio per
le popolazioni mononucleate (Tab. I). La procedura adottata permette
di ottenere un CLP molto ricco in PLT che correlano significativamente
con la concentrazione dei fattori di crescita piastrinici
(PDGF-AB, TGF-β1), dopo attivazione con trombina.
Le correlazioni evidenziate (Tab. I) fra le concentrazioni delle
cellule Pre-raccolta e del CLP consente una stima dei livelli di
concentrazione per singola popolazione cellulare in ogni singolo
paziente. Questa dipendenza dimostra come la configurazione di
separazione adottata possa fornire un’emocomponente di composizione
prevedibile, con la possibilità di stimare cosa e quanto
si va ad applicare sul tessuto leso, a tutto vantaggio della qualità
della terapia. Studi di caratterizzazione del CLP prodotto hanno
permesso di verificare inoltre una significativa presenza di cellule
staminali CD34+ (81.3 ±26.7 /µL) un importante progenitore emopoietico/endoteliale,
cellule ottenute senza preventiva stimolazione
con fattori di crescita emopoietici del paziente, e processando un
volume ematico relativamente basso (1544 ±191 mL). La discreta
correlazione (r = 0.52) rilevata nel CLP fra cellule mononucleate
e CD34+ permette un’agevole stima della concentrazione dei
progenitori CD34+ raccolti con il separatore cellulare, confermando
efficacia e standardizzazione della procedura di separazione
adottata. I saggi clonogenici effettuati sui CLP hanno evidenziato
che l’87% degli emocomponenti testati danno origine a Colony
Forming Units (CFU) contabili, dimostrando che i progenitori
CD34+ implicati nella formazione delle CFU, sono funzionali nei
CLP che hanno dato crescita clonale. La caratterizzazione fenotipica
delle CFU cresciute nei terreni liquidi seminati con aliquote
di CLP e coltivati per 72 ore indicano che le cellule che compongono
le CFU esprimono un pattern tipicamente mesenchimale:
CD105(SH2)-endoglina+, CD73(SH3/4)+, KDR+, Collagene I°+,
CD33+, CD34- (5).
Per quanto riguarda la membrana leuco-fibrino-piastrinica nella
matrice fibrinica rimangono incluse la quasi totalità delle cellule
Tab. I. Composizione cellulare dei concentrati leuco-piastrinici (CLP), comparazione e correlazione con i controlli Pre-raccolta (n = 45).
Pre-raccolta CLP Fattore di arricchimento Coefficente di correlazione (r)
PLT (x 10 3 /µL) 274 ±64 4454 ±1239 * 16.6 ±4.2 0.58 **
WBC (x 10 3 /µL) 6.37 ±1.7 80.9 ±24 * 13 ±3.3 0.57 **
MN (x 10 3 /µL) 2.3 ±0.5 64.4 ±15.2 * 28.3 ±5.5 0.61 **
PLT, piastrine; WBC, white blood cells; MN, cellule mononucleate totali. I dati sono rappresentati come media ±SD. Comparazione, * p