30845 Suppl Giot.pdf - Giornale Italiano di Ortopedia e Traumatologia

con grande successo nel trattamento di difetti ossei e fratture in
forma di placche, viti, spaziatori, chiodi.
Il titanio trabecolare ha una elevata biocompatibilità, ha il vantaggio
di avere una grande resistenza meccanica e quindi, utilizzato
come scaffold, di poter sopportare forze elevate anche prima che si
sia formato nuovo tessuto osseo.
Gli scaffold polimerici invece hanno la caratteristica di essere
impianti transitori perchè riassorbibili e di poter veicolare fattori
bioattivi necessari alla crescita di nuovo tessuto osseo come le
BMP. Essi inoltre hanno caratteristiche meccaniche (resistenza alla
compressione e rigidità) simili a quelle del tessuto ospite finchè
non sono sostituiti dal nuovo tessuto osseo. Durante il processo di
biodegradazione si formano monomeri come acido lattico e acido
glicolico che sono facilmente eliminabili dalle cellule seguendo le
normali vie cataboliche e quindi non si accumulano nell’organismo
e non risultano tossici.
Scopo di questa ricerca è di valutare con tecniche di microscopia
elettronica, di biologia molecolare e di biochimica la biocompatibilità
di tre diversi tipi di scaffold, uno costituito da titanio
trabecolare, uno da acido polilattico-co-glicolide (PLGA) e un
altro da acido polilattico-co-glicolide miscelato a idrossiapatite
(PLGA/HA) e inoltre la capacità delle cellule staminali di tessuto
adiposo di aderire, proliferare e differenziare in senso osteogenico
su questi scaffold per poter essere utilizzate con successo per la
riparazione di tessuto osseo danneggiato.
MaTErIaLI E METODI
Le ADSC sono state ottenute da tessuto adiposo sottocutaneo
umano per digestione enzimatica con collagenasi di tipo II per 1
h a 37°C in bagno termostatato agitante secondo Gastaldi et al. 3 .
Le ADSC ottenute erano sospese in terreno DMEM F12-HAM
contenente FBS 10%, penicillina/streptomicina 100 U e anfotericina
[terreno di crescita] e lasciate crescere fino a raggiungere
una confluenza del 90% in termostato in presenza di CO 2 al 5%
a 37°C. Il terreno era cambiato due volte la settimana. Le cellule
aderenti erano quindi tripsinizzate e 1 x 10 5 ADSC per 100 mm 2
erano seminate in fiasche con lo stesso terreno di crescita. Questo
passaggio era ripetuto tre volte. La presenza o assenza dei marker
di superficie CD73, CD90 e CD45 delle cellule ottenute era valutata
con citofluorimetria a flusso.
Semina sugli scaffold
Al terzo passaggio 4.5 x 10 5 cellule tripsinizzate erano seminate
sugli scaffold posti in multi-well e lasciati aderire alla struttura
per 2 h in termostato prima dell’aggiunta di 3 ml di terreno di
crescita.
Per indurre il differenziamento osteogenico, dopo 7 giorni dalla
semina sugli scaffold, il terreno di crescita era sostituito da DMEM
F12-HAM contenente FBS 15%, beta-glicerofosfato 10 mM, desametazone
100nM, acido ascorbico 0.05 mM, antibiotici e anfotericina
(terreno osteogenico) per tutto il periodo di coltura.
Scaffold
Gli scaffold di titanio trabecolare erano forniti dalla ditta Lima-Lto
S.p.A. (Lima, Villanova di San Daniele del Friuli, Italia); avevano
G. Gastaldi, et al.
una porosità del 65% con un diametro dei pori di 640 μm. Gli
scaffold di PLGA e PLGA/HA erano preparati con il metodo di
Dorati et al. 4 utilizzando una soluzione di PLGA (15% w/v in
1,4-Dioxano) e una sospensione di idrossiapatite 5% in PLGA.
Come porogeno erano utilizzate particelle di NaCl con diametro
di 600-1180 µm. La porosità degli scaffold di PLGA era 84% e
quella degli scaffold di PLGA/HA era 75%, il diametro dei pori era
compreso tra 300 e 350 µm. Tutti gli scaffold avevano una altezza
di 6 mm e un diametro di 12 mm.
Microscopia elettronica a scansione
La microscopia elettronica a scansione era eseguita sui tre diversi
tipi di scaffold su cui erano fatte crescere e differenziare le ADSC
per 21 giorni seguendo il metodo descritto da Gastaldi et al. 3 .
Attività della fosfatasi alcalina, marker del differenziamento osseo
L’attività della fosfatasi alcalina era valutata nelle cellule seminate
sugli scaffold di titanio trabecolare e coltivate in terreno di crescita e
osteogenico per 21 giorni. Il lisato cellulare era incubato a 37°C per
30 min in tampone glicina 50 mM, MgSO 4 1 mM, ZnSO 4 1 mM , pH
10.5, contenente p-nitrofenil-fosfato 5 mM. La reazione era bloccata
con l’aggiunta di NaOH 1 N e l’assorbanza del p-nitro-fenolo formato
letta a 410 nm. L’attività enzimatica era espressa come µmol
p-fenilfosfato idrolizzato/mg proteine ∙ min. La concentrazione delle
proteine del lisato cellulare era valutata col metodo di Lowry et al. 5
Isolamento del RNA totale e real-time PCR
L’RNA totale era estratto dalle cellule cresciute sugli scaffold di
titanio trabecolare in presenza e assenza di terreno osteogenico
per 7, 14 e 21 giorni con il reagente QIAzol (Qiagen SpA, Milano,
Italia). La reazione di trascrizione inversa del mRNA a cDNA
era ottenuta con random esameri e l’enzima Trascrittasi M-MLV
(Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.). La PCR quantitativa (qPCR)
era eseguita in triplicato con 1 µl di cDNA e con i primer specifici
della fosfatasi alcalina (for: AGC CCT TCA CTG CCA TCC TGT;
rev: ATT CTC TCG TTC ACC GCC CAC) secondo il metodo di
Laforenza et al. 6 . La qPCR era normalizzata usando come gene
housekeeping GUSB (QT 00046046 QuantiTect Primer Assay,
Qiagen) e i risultati erano espressi come fold change rispetto al
valore a 7 giorni di coltura.
Estrazione delle proteine della matrice extracellulare
Al termine del periodo di coltura le proteine secrete dalle ADSC
negli scaffold erano estratte e la quantità di fosfatasi alcalina presente
dosata con metodo ELISA 3 .
rISuLTaTI
L’analisi al citofluorimetro mostrava che le ADSC erano positive
per i marker di superficie CD73 e CD90 (tipici delle cellule staminali
mesenchimali) e negative per il marker CD45 (marker delle
cellule della linea ematopoietica) in accordo con i dati di letteratura
(Fig. 1) 7 .
Lo studio al microscopio elettronico a scansione mostrava che le
ADSC coltivate e differenziate per 21 giorni sui tre diversi tipi
di scaffold erano in grado di proliferare e produrre una abbon-
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