4. Uluslararası Beyaz Et Kongresi

Materyal ve Metod
DNA İzolasyonu
İncelenecek olan tavuk sekum örneklerinden GeneJet Genomic DNA Purification Kit (Thermo
Scientific) ile üretici firmanın talimatlarına uygun şekilde DNA ekstraksiyonu gerçekleştirildi.
Elde edilen DNA -20C’de kullanılana kadar saklandı.
PCR ve NGS Analizi
Örnekler, Ion 16S Metagenomics Kit ve Ion PGM Hi- Q Sequencing Kit (iontorrent, Thermo
Fischer) kullanılarak sekanslamaya hazırlandı. İlk olarak DNA ekstraklarında 16S rDNA gen
bölgeleri, amplifikasyonda taksonlar arasında fark gösterebilen 9 varyasyon bölgesine göre
tasarlanmış primer setleri kullanılarak çoğaltıldı. Daha sonra, 5’ uçlara yaklaşık 25 bazlık
adaptörler takılarak barkodlama işlemi gerçekleştirildi. Tavuk sekumu içindeki bakteri miktarını
belirlemek için RT- PCR kullanıldı. Bu adımı takiben, emülsiyon PCR’ı Ion Sphere parçacıkları
üzerinde gerçekleştirildi. Kalıp DNA’lar ile kaplanmış Ion Sphere mikropartiküller Ion
Chip’lere kısa bir santrifüjleme basamağı ile yüklendi. Ardından bu çip PGM cihazına yüklendi.
Bu parçacıklar üzerindeki adaptörlere bağlanmış primerlerin kullanımıyla hedef DNA’nın
amplifikasyonu sırasında, diziye giren her bir nükleotit ortam pH’ında değişikliklere neden
olarak Ion Chip vasıtasıyla cihaz server’ına aktarıldı. Ardından bu veriler İon Reporter yeni
nesil sekans veri analizi programında işlendi.
Bulgular
Metagenomik analizin konsensus sonuçlarına göre 7 filuma bağlı, 13 sınıf, 18 takım, 40 familya,
32 cins ve 30 tür belirlendi. Kantitatif olarak konsensusun %99’unun Firmicutes, %0.9’unun
Proteobacteria, geri kalanın Actinobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria, Synergistetes ve
Tenericutes filumlarına ait olduğu bulundu. Firmicutes filumu içinde Clostridia sınıfı %51,
Erysipelotrichia %42, Negativicutes %4 ve Bacilli %2 oranında saptandı. Tüm prokaryotlar ve
Firmicutes’ler içinde en yüksek oranda bulunan türler ise %28 ile Clostridium spiroforme, %9 ile
Faecalibacterium prausnitzii ve %3 ile Ruminococcus torques oldu. Ayrıca probiyotik özellikleri
bilinen 6 Lactobacillus türü oldukça düşük düzeylerde bulundu. Hayvanlarda bu dengesizliğe
neden olduğu düşünülen diyet maddeleri çıkartılıp yararlı bakterileri çoğaltacak yem maddeleri
katıldığında hayvanların bir süre sonra normal ağırlık artışını yakaladıkları görüldü.
Tartışma ve Sonuç
Gelişim geriliği bulunan tavuklardaki sekum mikrobiyomu incelendiğinde; hayvanlardaki sekum
disbiyozisinin iota toksin üreten C. spiroforme’den kaynaklanabileceği ve F. prausnitzii ve
Lactobacillus gibi yararlı bakterilerin mikrobiyatayı düzeltebileceği düşüncesine varılmaktadır.
Bu çalışma sonucunda; mikrobiyomun, hayvanların gelişimden infeksiyonlara kadar birçok
parametreyi etkilediği görülmüştür.
405