4. Uluslararası Beyaz Et Kongresi

Bu çalışma sonucunda elde edilen veriler ile önemli kanatlı bakteriyel patojenlerinin teşhisine
yönelik spesifik ve hızlı tanı yöntemleri geliştirilebilecektir.
Materyal ve Metot
Materyal olarak 2001-2015 yılları arasında Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji
Anabilim Dalı kanatlı teşhis laboratuvarında, kanatlı iç organ ve altlık materyalinden izole
edilen farklı taksonomik düzeydeki aerobik bakterileri, değişen konsantrasyonlarda içeren
bakteri kokteyli kullanıldı. Bu amaçla MacFarland 0.5’e göre ayarlanmış Gram pozitif
(Corynebacterium, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus cinsleri içerisinde yer
alan türler) ve Gram negatif (Bordetella, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Salmonella,
Serratia, Pseudomonas cinsleri içerisinde yer alan türler) bakteri kültürleri karıştırıldı. Elde
edilen bu bakteri kokteylinden ticari kit ile [GeneJet Genomic DNA Purification Kit (Thermo
Scientific)] total DNA ekstraksiyonu yapıldı. Total DNA’da bulunan 16S rDNA değişken
bölgeleri Ion 16S Metagenomics ve Ion PGM Hi- Q Sequencing Kit (ThermoFisher) ile
firmanın bildirdiği yönteme göre incelendi. Bu amaçla, 5’ uçlara yaklaşık 25 bazlık adaptörler
takılarak barkodlama işlemi gerçekleştirildi. Bakteri konsantrasyonunu belirlemek için qPCR
kullanıldı. Bu adımı takiben, emülsiyon PCR’ı Ion Sphere parçacıkları üzerinde gerçekleştirildi.
Kalıp DNA’lar ile kaplanmış Ion Sphere mikropartiküller Ion Chip’lere kısa bir santrifüjleme
basamağı ile yüklendi. Ardından bu çip PGM cihazına yüklendi. Bu parçacıklar üzerindeki
adaptörlere bağlanmış primerlerin kullanımıyla hedef DNA’nın amplifikasyonu sırasında, diziye
giren her bir nükleotit ortam pH’ında değişikliklere neden olarak Ion Chip vasıtasıyla cihaz
server’ına aktarıldı. Ardından bu veriler İon Reporter yeni nesil sekans veri analizi programında
işlendi. Metagenomik analiz sonucu elde edilen 9 adet değişken bölge sekansı firmanın kendi
veri bankası ve NCBI GenBank’taki veriler ile karşılaştırılarak kesin bakteri isimlendirilmeleri
yapıldı.
Bulgular
Metagenomik analizde, 6 farklı 16S rDNA bölgesine dayanan 150 baz okuma uzunluğu, minimal
10 okuma sayısı, %99 tür ve %97 cins homoloji eşiği değerlendirmeye alındı. Konsensus
sonuçlarına göre bakteriyel karışımda 3 filum, 4 sınıf, 9 takım ve 14 familyaya bağlı 25 cins ve
34 tür belirlendi. Deneysel karışıma katılan tüm cinsler metagenomik analizde ayırt edildi. Yeni
nesil sekansta farklı primer bölgelerinin bakteri identifikasyonundaki etkinliği incelendiğinde,
v2, v3, v4, v6/7, v8 ve v9 bölgelerinin sırasıyla 13, 16, 3, 9, 5 ve 5 türün ve sırasıyla 8, 13, 3, 6,
5 ve 5 cinsin identifikasyonunda yer aldığı belirlendi. Geçerli okumalarda v2, v3, v4, v6/7, v8
ve v9 bölgelerini hedefleyen primerlerin payı sırasıyla %8.9, %34.7, %11.8, %12.6, %14.2 ve
%17.5 olarak bulundu.
Klasik bakteriyolojik yöntemler ile teşhis edilen ve kokteyl içerisine konulan etkenlerin
metagenomik analizi sonucu elde edilen sonuçlarının (Tablo1) farklılık gösterdiği, cins düzeyinde
konulan kültürlerin metagenomik analiz sonucu daha spesifik tür düzeyinde isimlendirildiği
görüldü.
561