4. Uluslararası Beyaz Et Kongresi

Son yıllarda yapılan çalışmalarda, L. monocytogenes izolatlarının moleküler karakterizasyonunda;
ERIC-PCR parmak izi metodunun pratik, ekonomik ve yüksek güvenirliliğe sahip olması gibi
avantajları nedeniyle DNA analizlerinde kullanılabileceği bildirilmiştir. Yöntem, tek bir bakteri
türünde net bir DNA parmak izinin oluşturulması için kullanılabilmektedir (6,7).
Bu çalışmada bir yıl boyunca çeşitli kanatlı mezbahalarından toplanan toplam 121 adet piliç
boyun derisi örneklerinden L. monoytogenes izolasyonu, PCR ile izolatların doğrulanması,
multipleks PCR ile serotip tayinlerinin yapılması ve elde edilen L. monocytogenes izolatlarının
ERIC-PCR parmak izi analizi ile genetik yakınlıklarının belirlenmesi amaçlanmıştır.
Materyal ve Metot
Örnek toplama :On iki aylık bir periyotta, üç farklı kanatlı kesimhanesine yapılan aylık
ziyaretlerde toplam 121 adet piliç boyun derisi L. monocytogenes izolasyonu amacıyla
toplanmıştır. Boyun derisi örnekleri mezbahada kesim aşamasında paketleme öncesinde steril
makas ve pens yardımı ile steril numune poşetlerine alınarak soğuk zincir altında laboratuvara
getirilmiştir.
Listeria monocytogenes izolasyonu :Karkas sürüntü örnekleri ve 10 g boyun derisi örnekleri
90 ml Half Frasier Broth (Oxoid CM895, SR156) ile filtreli steril numune torbalarına konulup
homojenize edildikten sonra 30ºC’de 24 saat inkübe edilmiştir. Çalışmada, L. monocytogenes
izolasyonu amacıyla immuno manyetik separasyon (IMS) bazlı kültür tekniği kullanılmıştır.
IMS ile zenginleştirilmiş materyal, MOX Agarın (Modifiye Oxford Agar; Oxoid CM 856, SR
140) ve Kromojenik Listeria Agara (Chromogenic Listeria Agar (ISO) Base, Oxoid CM1084;
OCLA (ISO) Differential Supplement, SR0244E; OCLA (ISO) Selective Supplement, SR0226E)
çizildikten sonra, petriler 35-37ºC’de 24-48 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyonu takiben, MOX
ve Kromojenik Listeria Agarda üreyen şüpheli kolonilerden 1-5 adet seçilerek biyokimyasal
ve diğer testler yapılmak üzere, TSA-YE’ye (Tryptic Soy Agar-Yeast Extract; Oxoid CM 131)
geçildikten sonra plaklar 30°C’de 24 saat inkübe edilmiştir. Üreyen kolonilere sırası ile; Gram
boyama, katalaz (%3’lük H 2
O 2
ile), oksidaz (Bactident oxidase, Merck 113300) ve 20-25°C’de
SIM mediumda (Sulfide Indole Motility Medium; Merck 5470) hareketlilik, CAMP, nitrat
redüksiyon ve karbonhidrat fermentasyon testleri (mannitol, ramnoz ve ksiloz) yapılmıştır.
İdentifiye edilen L. monocytogenes izolatları, TSB-YE’de 4°C’de, gliserinli kriyovialler ise
-86°C’de dondurularak saklanmıştır.
L. monocytogenes izolatlarının PCR ile doğrulanması. İzolatların PCR ile analizinde DNA
ekstraksiyonu yapılmış ve pozitif kontrol olarak kullanılan L. monocytogenes ATCC 7644
referans suşu ile PCR koşulları optimize edilmiştir. Çalışmada, L. monocytogenes için hlyA
gen sekansını oluşturan (PCRGO: 5’ GAA TGT AAA CTT CGG CGC AAT CAG 3’; PCRDO:
5’ GCC GTC GAT GAT TTG AAC TTC ATC 3’) (hlyA [listeriolysin-O] 388 bp) primer çifti
kullanılmıştır. %1.5’luk agaroz jelde, 100 Volt elektirik akımında elektroforez işleminin ardından
sonuçlar UV ışığı altında değerlendirilmiştir.
Multipleks PCR ile L. monocytogenes’lerin Serotiplerinin Belirlenmesi: Piliç boyun derisi
örneklerinden izole edilen ve PCR ile doğrulanan L. monocytogenes izolatlarının serotiplendirilmesinde
Doumith ve ark. (8) tarafından geliştirilen primerler ve multipleks PCR tekniği kullanılmıştır. Buna
göre; i) 691 bp ağırlığında bant veren örnekler serotip 1/2a (3a), ii) 471 bp ağırlığında bant veren
örnekler serotip 1/2b (3b), iii) 691 ve 906 ağırlığında bant veren örnekler 1/2c (3c), iv) 471 ile 597 bp
ağırlığında bant veren örnekler serotip 4b (4d, 4e) olarak değerlendirilmiştir.
542