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288GARRIDO, J.M. et al.incubación durante toda la noche a 4 ºC. Al díasiguiente se hacían el resto de las prediluciones conPBS-T hasta conseguir la dilución final de suero.Los sueros se testaban por duplicado y en cada placase incluían un control positivo y otro negativo(ambos por duplicado) para controlar la variabilidadinterplacas. Tras una incubación a temperaturaambiente en cámara húmeda se lavaba tres vecescon PBS-T, se añadía el conjugado y tras una nuevaincubación a temperatura ambiente en cámarahúmeda, se volvía a lavar con PBS-T. Finalmentese añadía el sustrato (ABTS u OPD) que se incubabaa oscuras durante 20 minutos a temperaturaambiente. Al cabo de este tiempo se paraba la reaccióny se leía la densidad óptica a 405/450 nm. Losvalores finales se transformaban en un índice ELISA(IE) que se obtenía dividiendo el valor medio de ladensidad óptica del suero problema entre la mediadel control positivo.Las modificaciones que se evaluaron para lapuesta a punto del ELISA fueron las siguientes:• La dilución del suero• El tipo de conjugado:- Proteina G Peroxidasa (PG-POx)- Proteina G Biotinizada + Avidín Peroxidasa(PG-B+AvPOx)- Proteina G Biotinizada + Avidín FosfatasaAlcalina (PG-B+AvPA)- Conjugado anti-IgG ovino marcado con Peroxidasade rábano (RASh-POx)• Las diluciones del conjugadoPara la puesta a punto de la técnica se utilizarontres controles positivos: SIMA positivo débil (SP),control positivo comercial (CPC) (Allied Monitor,Inc., Fayette, Missouri, USA) y SIMA vacunal (SV),en orden creciente de intensidad de la reacción.Asimismo se disponía de un control negativo formadomediante la mezcla de varios sueros procedentesde un rebaño libre de paratuberculosis. Estesuero negativo se utilizó durante la fase de puesta apunto del protocolo ELISA para determinar la relaciónrespuesta/ruido (DO del suero problema divididapor la DO del suero negativo) de cada combinaciónde factores y seleccionar la más alta.La validación de la eficacia diagnóstica se llevóa cabo sobre una muestra de sueros de animales pertenecientesprincipalmente a rebaños procedentesde las Comunidades Autónomas del País Vasco y deAragón, así como algunos casos recibidos en ellaboratorio de diagnóstico de NEIKER (SIMA) deotras comunidades cuyo estado paratuberculosohabía sido definido mediante cultivo y examen histopatológico.Para la calificación histológica sesiguió una modificación de los criterios definidospor Pérez (1997) por la que se consideran 4 tipos deparatuberculosis ovina según el tipo de lesión granulomatosaobservada: Aislada-Delimintada (ADe),Multifocal-Delimitada (DeM), Difusa-Linfocítica(DiL) y Difusa-No Linfocítica (DiNoL) (Juste,1997).RESULTADOSLa primera prueba fue un ensayo para definir laconcetración del suero problema a la que se obteníala mejor relación respuesta/ruido. Para ello, se llevóa cabo un ELISA con diluciones seriadas del sueroSP y concentraciones crecientes de PG-POx en laque se determinó que la dilución de suero 1/600 yla concentración de PG-POx de 0.025 mg/ml eranlas que proporcionaban la mejor relación respuesta/ruido.A partir de estas concentraciones seprobaron todos los conjugados basados en proteínaG a diluciones seriadas, mientras que el conjugadoanti-IgG ovina con peroxidasa se mantuvo constantea la dilución usada en el ELISA convencional. Estosensayos se hicieron todos a la misma dilución delsuero con los tres sueros positivos de referencia (SP,CPC, SV). Así, se confirmó que la PG-POx mostrabaun pico de respuesta/ruido a la concentraciónde 0.025, 0.05 o 0.1mg/ml según se tratase de sueroSP, CPC o SV. Esta progresividad se interpretócomo que al aumentar el número de complejos antígeno-anticuerpo,mayor debería ser la cantidad deconjugado necesaria para ocuparlos completamente.El resto de conjugados, tanto los basados en proteínaG como en anti-IgG proporcionaron siempremenores relaciones respuesta/ruido.Una vez establecidas las mejores condiciones dela reacción ELISA se procedió a validar la eficaciadiagnóstica con los sueros de los animales de referencia.Este estudio puso de manifiesto que la mejorzona de corte se situaba entre unos índices ELISAdel 0.155 y del 0.220 cuando se consideraba cadauna de las distintas referencias posibles. Sinembargo, cuando se usaba una combinación de referenciabacteriológica e histopatológica al mismotiempo el punto de corte óptimo se lograba a uníndice 0.203 (Figura 1).