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292GARRIDO, J.M. • CORTABARRÍA, N. • ADÚRIZ, G. & JUSTE, R.A.de enriquecimiento-decontaminación utilizado parael aislamiento. En ambas una suspensión de 1 g deheces en solución de detergente se maceró en undigestor Stomacher. Tras sedimentación hasta suseparación en dos fases, se recogió la fase superiorcon una pipeta desechable desde la que se vertió entubos de centrífuga en los que se lavó tres veces conPBS. En el último de los lavados el sedimento setransfirió a un tubo de 2 ml con tapón de rosca quese utilizó en los siguientes pasos de extracción.A partir de ese momento se procedió a la extraccióndel ADN fraccionada en tres partes: lisis de lapared micobacteriana, separación de las fases y precipitacióndel ADN. Para producir la lisis de la resisitentepared micobacteriana se probaron métodosenzimáticos, físicos, químicos y combinaciones delos dos últimos. Los métodos enzimáticos sebasaban en la utilización de Lisozima y ProteinasaK, que siendo usada junto con el SDS favorece laextracción del ADN fuertemente unido a las cromatinas.Los métodos físicos empleados fueron elbaño seco a altas temperaturas, el choque térmicomediante congelación en nitrogeno líquido y descongelaciónen baño seco, la acción del microondas,o la acción del mini Bead-Beater. Los métodos químicosutilizaron compuestos como la Guanidina Isotiocianato(GE), Tris EDTA enriquecido con TritonX100 (TE-Triton X100) y el DNAzol. La separaciónde fases se llevó a cabo mediante mezcla conCloroformo-Octanol en la proporción 24:1, quetiene la capacidad de hacer insolubles las proteinaso incluso desnaturalizarlas y la precipitación delADN mediante Isopropanol que, además de precipitarel ADN, elimina restos de los compuestos anterioresque podrían interferir en la PCR.El rendimiento relativo de cada una de las alternativasbásicas de tipo de detergente a diferentesconcentraciones para el enriquecimiento y para cadatipo de método de extracción se comparó mediantelectura de la concentración de ADN en la soluciónfinal en espectrofotómetro a 260/280 nm.Una vez obtenida la muestra de ADN se procedióa la amplificación de la misma, utlizando cebadoresespecíficos de la secuencia de inserción IS900 (Varyet al., 1990; Van der Giessen et al., 1992; Whippleet al., 1992). Cada muestra problema se analizó porduplicado, así como los controles positivo y negativode PCR y el control negativo de extracción.Posteriormente el producto amplificado se visualizóy reveló en gel de agarosa al 2% con bromuro deetidio sometido a luz ultravioleta. Las muestras eranconsideradas positivas cuando al menos una de lasmuestras era positiva, siempre que los controles presentasenlos resultados esperados.Una vez escogido tanto el método de enriquecimientocomo el de extracción se procedió a la validaciónde la eficacia diagnóstica sobre una muestrade heces de animales pertenecientes a rebaños de laComunidad Autónoma Vasca en los cuales se habíadetectado algún animal con sintomatología, aunquegran parte de los 34 animales estudiados eranenfermos subclínicos. El estado paratuberculosoindividual de estos animales se definió medianteexamen microscópico, cultivo fecal o inmunodifusiónen gel de agar. En dos de ellos, estos resultadostambién se confirmaron mediante examen histopatológico.RESULTADOSLa comparación entre detergentes mostró que eluso de SDS al 5% proporcionaba la mayor riquezay pureza de ADN para todos los métodos de extracción.Entre éstos se pudo observar que los mejoresresultados se obtuvieron con Baño seco a 100º C(100º C), Congelación-Descongelación (C-D),Bead-Beater (B-B) y Microondas (Mic), siendo utilizadosen combinación con TE-Triton X100, GE yDNAzol. En este caso, la mayor riqueza y purezaen ADN se obtuvo con el método de Congelación-Descongelación en combinación con el uso de TE-Triton X100. Estos resultados en riqueza de ADNse confirmaron en la práctica al comprobarse quelas mejores amplificaciones de la PCR se obteníantambién a partir del material obtenido por losmétodos mencionados.