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290GARRIDO, J.M. et al.Tabla 2. Prestaciones del ELISA PG-POx enrelación con las técnicas de referencia tomadasen combinación.CULTIVO/LESIONESPos Neg TotalPos 25 0 25ELISA Neg 1 9 10Total 26 9 35Al considerar como animales positivos aquelloscuyo resultado frente a cualquiera de las dos técnicasfuese positivo, los valores de sensibilidad yespecificidad mejoraron notablemente, hastaalcanzar una sensibilidad del 96,15% y una especificidaddel 100.Esta elevada especificidad ofrece garantías parala sustitución de la técnica de inmunodifusión engel de agar (IDGA) que se caracteriza por una elevadaespecificidad, pero que muestra escasa sensibilidady precocidad y que además resulta más lentoy laborioso para grandes números de muestras.CONCLUSIONES- El uso de la proteína G conjugada con peroxidasade rábano mostró las mejores prestaciones entérminos de relación respuesta/ruido en el ELISAadsorbido con PPA-3 para la detección de anticuerposfrente a antígeno de paratuberculosis.- La aplicación del protocolo ELISA PG-POxdesarrollado en este estudio a sueros de animales dereferencia en relación con la paratuberculosis pusode manifiesto que este método tiene una alta eficaciadiagnóstica para animales con formas de paratuberculosisdesde Multifocal-Delimitada hastadifusas (DiL y DiNoL).- Este método podría tener una elevada utilidadpara el control de la paratuberculosis ovina ya quepermite detectar eficientemente todas las formas concargas bacterianas elevadas que son las que suponenel mayor riesgo epidemiológico.REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICASADURIZ, J.J.. 1993. Tesis Doctoral: Epidemiología,Diagnóstico y Control de la Paratuberculosisovina en la Comunidad Autónoma del País Vasco.DIMARELI-MALLI, Z.; SARRIS, K.; XENOS, G.y PAPADOPOULOS,G.. 1991. Comparison ofthe ELISA, AGID, and CF tests for the diagnosisof caprine and ovine paratuberculosis. Third InternationalColloquium on Paratuberculosis.Orlando, Florida USA.HILBINK, F.; WEST,D.M.; DE LISLE, G.W.; KIT-TELBERGER,R.; HOSIE,B.D.; HUTTON, J.;COOKE, M.M.y PENROSE, M.. 1994. Comparisonof a complement fixation test and twoabsorbed and unadsorbed ELISAs for the diagnosisof paratuberculosis in sheep. Vet Microbiol,Vol. 41: 107-116.JUSTE, R.A.. 1997. Johne’s disease: a review ofcurrent knowledge. 4th Int Cong Sheep Vet. Armidale.Australia.MILNER, A.R.; LEPPER, A.W.D.; SYMONDS,W.N. y GRUNER, E.. 1987.Analysis by ELISAand Western blotting of antibody reactivities incattle infected with Mycobacterium paratuberculosisafter absortion of serum with M. Phlei.Res Vet Sci, Vol. 42:140-144.PÉREZ, V.; GARCÍA MARÍN, J.F.y BADIOLA,J.J..1996. Description and classification of differenttypes of lesion associated with natural paratuberculosisinfection in sheep. J Comp Path, Vol.144: 107-122.YOKOMIZO, Y.; YUGI, H.y MERKAL, R.S..1983.A method for avoiding false-positive reactions ina enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)for the diagnosis of bovine paratuberculosis. JpnJ Vet Sci,
Producción Ovina y Caprina • 1998 • XXIII: 291-294UTILIZACIÓN DE LA PCR COMO TÉCNICA DE DIAGNÓSTICO DEPARATUBERCULOSIS A PARTIR DE HECESGARRIDO, J.M.; CORTABARRIA, N.; ADÚRIZ, G. y JUSTE, R.A.NEIKER (Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario) [SIMA].Berreaga, 1. 48160 Derio, Bizkaia.RESUMENLa necesidad de disponer de métodos eficientes y prácticos de preparación de las muestras fecales para suuso en un prueba PCR para el diagnóstico etiológico de la paratuberculosis hizo que se plantease un ensayode comparación de diferentes métodos de extracción y purificación del ADN de M. a. paratuberculosis. Trassu aplicación a una muestra de heces de un caso natural de paratuberculosis, se definieron las condiciones detrabajo que proporcionaban la máxima sensibilidad relativa en la detección de la presencia de M. a. paratuberculosis.Posteriormente se procedió a validar la eficacia diagnóstica ampliando el numero de muestras a34 animales procedentes de diferentes rebaños de la CAV que presentaban respuesta humoral, cultivo, olesiones macro y microscópicas positivas a paratuberculosis. A partir de este material se pudo estimar que lasensibiliad y la especificidad de este protocolo de PCR eran del 71,5% y del 92,3%, respectivamente.Palabras clave: ADN, micobacteria, sensibilidad, especificidad.INTRODUCCIÓNEl diagnóstico etiológico de la paratuberculosisha presentado tradicionalmente serias dificultades,tanto por los especiales requerimientos de cultivode la bacteria causal, como por la lentitud de su crecimiento.Estas dificultades se ven incrementadastodavía más en la especie ovina en la que numerososautores refieren fracasos del cultivo pese a la presenciamasiva de micobacterias en los tejidos afectados(Taylor, 1951; Juste et al., 1991). En consecuencia,el desarrollo de las técnicas PCR hizoesperar una rápida mejora del diagnóstico basadoen la detección de M. a. paratuberculosis. La escasadifusión de estas técnicas casi 10 años después(McFadden et al., 1988) sugería la necesidad dellevar a cabo un nuevo abordaje del problema. Enparticular se planteó la hipótesis de que quizá el problemano era la parte más sofisticada del procesosino la más elemental, esto es la fase de concentraciónde las micobacterias a partir del material fecal.Para poner a prueba esta hipótesis se realizó unacomparación entre diferentes métodos de concentraciónpublicados en la bibliografía relacionada conla PCR y a continuación se evaluó la eficacia diagnósticaen material procedente de animales de estadoparatuberculoso confirmado por diferentes técnicas.MATERIAL Y MÉTODOSEl material para la puesta a punto del protocololaboratorial de PCR se obtuvo de un animal infectadode forma natural al que se le recogieron lasheces durante 4 días con el fin de disponer de unacantidad suficiente de muestra de partida. Este materialse alicuotó y se congeló a -20º C para su usoposterior.El método de extracción de referencia del que separtió fue el descrito por Challans et al. (1994)basado en la separación de las fases acuosa y órganicade una mezcla de 1 ml de xilol con el 1 g dematerial fecal. En este método, las micobacterias seconcentraban en la fase órganica de la que seextraían mediante sucesivos lavados con una soluciónde NaOH 0.2M.Además de este método, se ensayaron dos alternativasbásicas (uso de SDS o de HPC) del método
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