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502PÉREZ-PÉ, R. et al.como distribución en contracorriente o CCD, quees un proceso cromatográfico con una fase estacionaria(inferior) y una fase móvil (superior). Si seincorpora un campo centrífugo (distribución en contracorrientecon centrifugación o CCCD) se reducenotablemente el tiempo de separación de las fases,evitándose así la pérdida de viabilidad celulardurante el proceso. En este trabajo se analizó elefecto de la adsorción de proteínas totales y lipoproteínasde plasma seminal ovino sobre espermatozoidessometidos a “cold-shock”, comparando lainfluencia del método de lavado de los espermatozoidessobre esta posible adsorción. Se estudió elefecto de las proteínas plasmáticas sobre espermatozoidesseparados del plasma seminal por dosmétodos distintos, el método de migración espermáticaconocido como “swim-up”, que además dacomo resultado una población enriquecida en célulasmótiles y viables, y el método de filtración, quetiene la ventaja de ser un método rápido y sencillo.MATERIAL Y MÉTODOSObtención y preparación de la muestraSe utilizó semen ovino procedente de cuatromoruecos de raza Rasa Aragonesa, obtenidomediante vagina artificial. Las extracciones se realizaroncada dos días y se empleó la mezcla de lossegundos eyaculados con el fin de eliminar diferenciasindividuales. El plasma seminal se eliminóen unos casos por el procedimiento de “swimup”/dextrano(García-López et al., 1996) y en otrospor filtración a través de filtros Millipore de 5 µm.Las muestras lavadas se sometieron a “cold shock”según el método citado por Watson (1981).Evaluación de la muestraLa viabilidad espermática se determinó mediantela tinción de fluorescencia con diacetato de carboxifluoresceínay ioduro de propidio (CFDA/PI)(Harrison y Vickers,1990). Tras la observación almicroscopio de fluorescencia, se estimó el porcentajede espermatozoides con membrana íntegra(impermeables al ioduro de propidio). En los experimentosde CCCD, se recogieron las células decada tres cámaras consecutivas y se tiñeron conjuntamente.Los resultados se expresan como porcentajede células viables en cada fracción.La concentración espermática se determinómediante la cámara de Neubauer.Obtención de proteínas totales y lipoproteínasseminalesLa obtención de proteínas totales se realizó comose describe anteriormente (Ollero et al., 1997) y laconcentración se determinó mediante el método deBradford (1976).Las lipoproteínas seminales se obtuvieronsiguiendo el protocolo de Kelley et al.(1986). Posteriormentese dializaron con medio de bifasedurante 12-16 horas y se determinó la concentraciónmediante microensayo de ácido bicinchonínico(BCA) (Smith et al.,1985).Preparación del sistema bifásicoEl sistema bifásico utilizado estaba compuestopor Dextrano T-500 5,5% (p/p), PEG 6000 2% (p/p),Ficoll 400 10,5% (p/p), sacarosa 0,25 M, EGTA 0,1mM, tampón fostato sódico 4 mM (pH 7,5), 10%(v/v) 10x tampón Hepes (glucosa 50 mM, Hepes100 mM, KOH 20 mM; pH 7,5).Distribución en contracorriente concentrifugaciónLa unidad de CCCD usada fue construida ennuestro laboratorio tomando como modelo la diseñadapor Akerlund (1984), y consiste en un rotorconstituido por dos platos concéntricos en los quese disponen circularmente 60 cavidades, quedandodividida cada una de ellas en partes superior e inferior,correspondiendo al plato interior y exterior respectivamente.El plato interior es móvil con respectoal exterior, de modo que al girar el primero sobre elsegundo se produce una trasferencia de las fasessuperiores sobre las correspondientes fases inferiores.En todos los experimentos se realizaron 29transferencias procesando dos muestras a la vez cargadasen la cámara 0 y 30 respectivamente, lo quepermite una comparación directa entre ellas. Lasproteínas seminales se depositaron en las cámarasde carga y en las cuatro anteriores. Después del procesose analizó el contenido de las cámaras realizandoel recuento de las células y el estudio de laviabilidad de las mismas. Los perfiles de CCCD presentadosson representativos de, al menos, tres experimentosdiferentes, y expresan el porcentaje decélulas contadas en cada fracción con respecto alvalor obtenido en la cámara que contiene el númeromáximo de células.