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296GÓMEZ, N. • GUTIÉRREZ, M.M. • GEIJO, M.V. & GARCÍA MARÍN, J.F.ción de la misma en el genoma, cortando el ADNproblema mediante enzimas de restricción quegeneran fragmentos de longitud variable. Las enzimasde elección empleadas son la Pvu II y la Alu I.- Out-PCR: Se basa en la amplificación de fragmentosde ADN a partir de un extremo conocido dela IS6110 mediante el empleo de PCR, estudiandola variación en el número y tamaño de los fragmentosobtenidos, estableciendo un patrón o tipopara cada aislamiento o grupo de ellos.- Spoligotyping: Basado en la variación que existeen una región denominada “direct repeat” (DR o“directamente repetida”) específica del complejo M.tuberculosis, identificando una serie de “espaciadores”conocidos de esta región (llamados DVR).En la actualidad se conoce perfectamente lasecuencia de nucleótidos tanto de la región “directamenterepetida” como de los espaciadores, de losque en este momento son utilizados un total de 43.Esta técnica de biología molecular permite obtenerun patrón característico para cada micobacteria delgrupo M. tuberculosis complex.En las técnicas de R.F.L.P. y out-PCR se emplearon19 aislamientos de Mycobacterium bovis, procedentesde cabras con lesiones tuberculosas de 5rebaños. Para la técnica de spoligotyping se utilizaron30 aislamientos de M. bovis procedentes de 9rebaños, estando incluídos en los mismos los empleadosen R.F.L.P. y out-PCR.RESULTADOS Y DISCUSIÓNTodos los aislamientos caprinos mostraron unpatrón característico mediante R.F.L.P., semejanteal ya publicado anteriormente (Gutiérrez et al,1995), compuesto por 6 a 8 secuencias de IS6110.En total se han obtenido 5 patrones diferentes (A ,B,C, D, E). En los rebaños IV y V se observaron enambos, dos patrones diferentes en varios aislamientos.Los dos rebaños estaban geográficamentecercanos, teniendo el mismo tipo de animales (cabra celtibérica) siendo común el intercambio deanimales entre los mismos. Los rebaños I, II, y IIIeran de localizaciones geográficamente distintasentre sí, siendo el I y el III de raza murciana y el IIdel tronco celtibérico (tabla 1).Tabla 1. Resultados de la técnica de R.F.L.P.Rebaño Localización (provincia) Raza Nº aislamientos (*) Patrón R.F.L.P.I Zaragoza Murciana 7 AII Castellón Celtibérica 1 BIII Valencia Murciana 1 CIV Castellón Celtibérica 4 D1 EV Castellón Celtibérica 1 D4 E(*) Cada aislamiento de M. bovis procede de un animal diferente del mismo rebaño.Los mismos resultados se apreciaron con las técnicasde out-PCR, diferenciando claramente losdiferentes aislamientos.Al emplear la técnica de spoligotyping, se observaron5 patrones diferentes pudiendo establecerse asociacionestanto geográficas como raciales (tabla 2).El patrón más común es el denominado como tipo“a”, con ausencia de espaciadores en las posiciones1, 3-16, 28, 30-33 y 39-43. Este patrón se observaen todas las cabras de los rebaños del Maestrazgode Castellón (raza celtibérica), así como en unrebaño de raza murciana del Valle el Ebro, distantesademás geográficamente. El patrón “b” (ausenciade espaciadores en posiciones 1, 3-16, 22, 23, 28,30-33 y 39-43) coincidiendo con cabras de la mismaraza y con localización cercana, así como en unrebaño (el número VI) que estaba constituído pormurciana y otros cruces, rean de reciente creacióny los animales procedentes de diversas procedencias,hecho que justificaría la presencia de trespatrones diferentes en otros tantos aislamientos.