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400GARCÍA, M.E. et al.Sueros: Utilizamos 2 tipos de sueros:* Sueros control: utilizamos un total de 20 suerosprocedentes de animales clínicamente sanosmantenidos en una explotación sanitariamentecontrolada y sin ningún antecedente de enfermedadfúngica.* Sueros de animales sospechosos: De los 96animales que componían el rebaño, se obtuvosuero de 90, mientras que los 6 restantes murieronantes que se pudiera efectuar la toma de sangre.Obtención de extracto antigénico de A.fumigatus:Preparamos extracto antigénico miceliarbasándonos en el método previamente descrito pornosotros (García et al., 1997), que podemos resumiren: se cultiva el hongo en medio líquido sintético(caldo Czapeck-Dox suplementado con 1%Dextrosa) durante 96 horas en agitación a 37 C.Tras el período de incubación, se obtiene el miceliopor filtración, se lava 3 veces con PBS, y seseca con ayuda de un papel de filtro. En estemomento se procede a macerar completamente elmicelio en un mortero, tras lo que el extracto sesomete a sonicación. Se centrifuga a 10.000 rpmdurante 30 minutos, se recoge el sobrenadante y sedializa frente a agua destilada. El contenido deltubo de diálisis se filtra a través de un filtro de0’45 µm y se concentra mediante el sistemaUltrafree-15 (Millipore) con una membrana de untamaño de exclusión de 10 kDa.El extracto antigénico así obtenido se somete adeterminación proteíca según el procedimiento deBradford.Metodología ELISA para el diagnóstico deaspergilosis ovina:Cada pocillo de la microplaca es tapizado con100 µl del extracto antigénico de A.fumigatus enuna concentración de proteínas de 5 µg/ml. Trasuna incubación de 72h a 4 C, se lava la placa 3veces con Buffer fosfato salino con 0’05% deTween 20 (PBS-T), tras lo que se añaden 100µl dela solución bloqueante constituida por AlbúminaSérica Bovina al 3% en PBS; se incuba durante 30minutos a temperatura ambiente, y se lava denuevo. Tras este paso, las placas pueden ser utilizadaso bien se pueden almacenar a -20 C para usoposterior. El siguiente paso es la adición de sueroproblema, 100µl en la dilución 1:5000. Se incuba1 hora a 37 C, tras lo cual la placa es lavada denuevo, y se adiciona el conjugado: 100µl de unadilución 1:10.000 de anti-IgG ovina conjugada conperoxidasa. Tras una nueva incubación de 1 hora atemperatura ambiente, se añaden 100µl de substrato,constituido por una solución de O-fenilendiamina,con incubación de 15 minutos a temperaturaambiente en oscuridad. La reacción se detiene porla adición de 50µl de ácido sulfúrico 6N, procediendoa leer la Densidad Optica de los pocillosmediante un lector de ELISA a 492 nm.RESULTADOSEstimación de la línea de corte: Los resultadosobtenidos con los 20 sueros control fueron lossiguientes, referidos a valores de Densidad Optica(DO) en ladilución 1/5000:Media (X) = 0’189Desviación Típica (SD) = 0’104X + 2SD = 0’397X + 3SD = 0’501Siguiendo los valores obtenidos, aplicamos lossiguientes criterios diagnósticos:- Valor positivo: DO por encima de 0’5.- Valor dudoso: DO comprendida entre 0’4 y 0’5.- Valor negativo: DO por debajo de 0’4.Diagnóstico de aspergilosis ovina: De los 96 animalesque componían el rebaño, se consideraronclínicamente afectados por el brote de mastitisaspergilar un total de 16 animales: 11 de ellos presentaronun curso agudo de la enfermedad, pudiéndoseobtener suero sólo de 5 de estos animales.Todos ellos resultaron claramente positivos porELISA, con valores de DO por encima de 0’9. Los5 animales restantes presentaron un curso crónicode la enfermedad, también resultaron todos positivosal ELISA, con valores por encima de 0’6 entodos los casos, y con evolución hacia la curacióntotal en 2 casos, y con pérdida de una mama en losotros 3.Del resto de los animales, podemos hacer unadiferenciación en 2 grupos:* 16 presentaron signos de mastitis crónica conlesiones no específicas de mastitis aspergilar. Eneste caso sólo 2 animales resultaron positivos alELISA.* Los otros 64 animales permanecieron asintomáticos,detectando sólo 5 positivos por ELISA.En una segunda toma de muestras, realizada 3semanas después, se observó seroconversión en