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300EXTRAMIANA, A.B. • CORTABARRÍA, N. • GARCÍA, M. • JUSTE, R. & GONZÁLEZ, L.importante a la hora de detectar el virus en su fasede latencia. Por otro lado se está evaluando unnuevo modelo de ELISA indirecto (Saman et al.,1997) basado en un antígeno recombinante, queparece ofrecer una mayor sensibilidad que la IDGAy una mejora en la estandarización de otros ELISAsdesarrollados hasta el momento. En este aspecto lacombinación de una técnica de biología molecularcon otra serológica permitiría detectar la infecciónincluso en aquellos animales en los cuales aún nose ha desarrollado una respuesta inmune.MATERIAL Y MÉTODOSEn este estudio se recogieron muestras de sangrecon EDTA y de suero sanguíneo de 109 ovejas ymuestras de leche de 64 de esas ovejas, procedentesde distintos rebaños de la CAV, algunos de elloslibres de la infección por el VMV (2) y otrosrebaños con distintos niveles de infección del VMV(7). Posteriormente se llevó a cabo el sacrificio dedichos animales para determinar la presencia oausencia de lesiones anatomopatológicas compatiblescon la enfermedad y se recogieron muestras dediversos órganos (bazo, pulmón, ganglios, ubre ysistema nervioso) para poder contrastar los resultadosde PCR en sangre con los de tejidos.Una vez hecho esto, se procedió a la extracciónde linfocitos de sangre periférica y de células deleche mediante diversos procesos de lavado y centrifugación.A partir de estas células se realizó laextraccción del ADN por digestion con la proteinasaK, purificación con fenol-cloroformo y precipitacióncon etanol. Este ADN se usó como moldepara la realización de la PCR (Reacción en Cadenade la Polimerasa), donde se emplearon cebadorescorrespondientes a la región LTR del genoma delVMV que amplifican un fragmento de 291 pares debases de una zona muy conservada y doblementerepetida en el ADN del provirus. Posteriormente losproductos amplificados se visualizaron mediantecorrido electroforético en geles de agarosa al 2%con bromuro de etidio e iluminación con luz UV.Por lo que respecta a los sueros sanguíneos, seprocedió a su análisis mediante IDGA por el métodoconvencional.RESULTADOSUna vez clasificados los distintos animales en tresgrupos distintos atendiendo a su estado serológico,los resultados de PCR quedan detallados en la tablaque se expone a continuación.Tabla 1.- Resultados de LTR PCR en Leucocitos de sangre periférica (LSP) y en Células de leche(CL) expresados en función de los distintos grupos de animales.Grupo 1Grupo 2Grupo 3Animales PCR LSP PCR CLIDGA -vosRebaños no infectados 0/18 0/12IDGA -vosRebaños infectados 20/27 10/16IDGA +vosRebaños infectados 53/64 19/36De los 7 animales que resultaron negativos a PCRen sangre en el Grupo 2, tres de ellos fueron positivosa PCR en al menos uno de los órganos dianaanalizados, mientras que 4 de los 6 animales negativosa PCR en leche resultaron positivos a PCR enalguno de los órganos. En el Grupo 3, 9 de los 11animales negativos a PCR en sangre presentaronresultados positivos de PCR en alguno de los tejidosestudiados y 13 de los 17 animales negativos a PCRen leche fueron positivos en alguno de los tejidosanalizados por PCR.Con este protocolo de PCR se obtuvo un mayornúmero de reacciones positivas en sangre comparadocon el resto de las muestras sometidas a estudio,si bien el ganglio mediastínico y la leche tambiénresultaron ser positivos en un alto número de casos.Por el contrario el bazo y el sistema nervioso centralfueron las muestras más frecuentemente negativas.