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332RODRÍGUEZ-PONCE, E. et al.Toxoplasma en una población de forma frecuente(Fleck, 1980) y poder persistir durante años con untítulo elevado (Welch et al., 1980; McCabe yRemington, 1983).MATERIAL Y MÉTODOSAnimales.- Para la realización de esta experienciase ha utilizado un lote de 25 cabritos de 1 mes devida pertenecientes a la Agrupación CaprinaCanaria. En el comienzo de la misma, los animalesfueron chequeados mediante determinación serológicafrente a la posible presencia de inmunoglobulinaG anti Toxoplasma gondii mediante la técnicaE.L.I.S.A. descrito por Calamel (1983). Los resultados,en todos los casos fueron negativos. Las hecesfueron analizadas mediante concentración por flotaciónen solución saturada de ClNa y sedimentaciónen formol-éter para determinar la posible presenciade parasitación. El control frente a coccidiosfue llevado a cabo con Amprolio (Amprol 20%MSD-Agvet). Así mismo, se realizaron frotis deheces mediante la técnica de Kinyoun para determinarla posible presencia de Cryptosporidium spp.Los resultados obtenidos fueron negativos.Inoculación.- La cepa de T. gondii utilizada fuela RH, cedida inicialmente por la Dra. Bessières del“Service de Parasitologie et Mycologie du C.H.U.Toulouse-Rangueil” (Francia) y mantenida medianteTabla 1. Recogida de muestras (Control) a lolargo del experimento (días post-inoculación–d.p.i.–)Controld.p.i.0 01 22 43 74 145 216 287 358 429 4910 5611 6312 7713 91pases continuos en cavidad peritoneal de ratones dela cepa Suiza como ha sido descrito con anterioridad(Maisonneuve et al., 1983).Los cabritos fueron agrupados en lotes de tres animalescada uno. Todos los animales fueron inoculadossubcutáneamente en la región escapular con1 mililitro de una suspensión de 2,5x10 6 taquizoítos/ml,a excepción de los pertenecientes al lotecontrol (lote 8).Colección de muestras de suero.- Antes ydurante la experiencia se extrajeron de forma seriadamuestras de sangre y suero con objeto de estudiarla respuesta inmune humoral. Dichas muestrasfueron obtenidas por punción aséptica en la venayugular y recogidas en tubos colectores (Venoject)permaneciendo las muestras en condiciones de refrigeracióndurante el tiempo de transporte hasta ellaboratorio. Para la obtención de suero, se centrifugarona 1.500 r.p.m. durante 5 minutos, y posteriormenteel suero fue alicuotado en viales de poliuretanode 1,5 ml y congelado a -20EC hasta su utilización.La Tabla 1 muestra los días post-inoculaciónque se corresponden con cada una de lasextracciones. Las extracciones realizadas han sidorecogidas en la Tabla 2 en función con los controlesa los que se corresponden.E.L.I.S.A.- El método E.L.I.S.A. fue el utilizadopara la determinación de la presencia de inmunoglobulinaG y M específicas en el suero. Para ladetección de IgG se utilizaron placas antigenadasservidas por el Laboratoire de Pathologie des PetitsRuminants et des Abeilles (CNEVA-LPPRA, Biot,Francia). El protocolo de actuación ha sido recogidocon anterioridad (Rodríguez-Ponce et al., 1995).Para la detección de IgM, se procedió a antigenarlas placas con una solución antigénica de T. gondiia 25 mg/ml en tampón carbonato pH 9,6, obtenidostras la rotura de los taquizoítos mediante pases decongelación-descongelación y posterior sonicadode los mismos (Malik et al., 1990). La concentraciónproteica fue determinada por el método deBradford mediante un kit comercializado por BIO-RAD (Bio-rad protein assay Bradford M. Anal.Biochem,1972). Las placas fueron antigenadas a 4ECdurante una noche. Posteriormente fueron lavadosen PBS-Tween 20 y saturadas durante 30 minutosa 37EC con PBS-BSA 3%. Las muestras de suerofueron diluídas a 1:100 en PBS-Tween 20 con0,002% de azida de sodio e incubadas durante 1hora a 37EC. Todas las muestras fueron realizadaspor duplicado. Tras lavar, se procedió a la incubaciónde las placas con una anti IgM caprina, revelándoseposteriormente la reacción con una anti-IgG
PERFÍL SEROLÓGICO DE LA TOXOPLASMOSIS EXPERIMENTAL CAPRINA333Tabla 2. Recogidas de muestras (Controles –C) en los distintos lotes experimentales.Lote1 Lote2 Lote3 Lote4 Lote5 Lote6 Lote7 Lote8C0 X X X X X X X XC1 X X X X X X X XC2 X X X X X X XC3 X X X X X XC4 X X X X XC5 X X X XC6 X X X XC7 X X XC8 X X XC9 X X XC10 X XC11 X XC12 X XC13 X Xde conejo-peroxidasa. Un último lavado y la adiciónde 100 ml/pocillo de O-PhenylenediaminaDihydrochloride (OPD-Sigma) a una concentraciónde 0,4 mg/ml en tampón citrato (utilizado como sustrato).La reacción fue frenada con ácido sulfúrico2M. La lectura se llevó a cabo a una longitud deonda de 492 nm.RESULTADOSLa Figura 1 muestra el comportamiento serológicofrente a las inmunoglobulinas específicas estudiadas.De esta manera, los 23 cabritos inoculadospresentan un incremento significativo de los anticuerposuna semana después de la infección para elcaso del isotipo IgM y a los 14 días en el caso delFigura 1. Perfil serológico (IgG e IgM específicos) de los animales inoculados con la cepa RH de Toxoplasma gondii.
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PRODUCCIÓN OVINA Y CAPRINAN.º XXI
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