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504PÉREZ-PÉ, R. et al.después de 1 hora de incubación. La recuperaciónde células con membrana íntegra aumentó en funciónde la concentración de proteínas añadidas (Fig.3). Un valor de integridad de membrana del 19% alcabo de 1 hora después del tratamiento aumentó a62% tras 1 hora de incubación con 2,6 mg de proteínas,lo que supone un porcentaje de recuperacióndel 106,95 %.Tras observar el efecto reversor de las proteínasplasmáticas totales, se repitió la misma serie deexperimentos con otra fracción del plasma seminal,la fracción lipoproteica, con dos cantidades distintas,700 y 1300 µg. Mientras la adición de estas cantidadesde proteínas plasmáticas totales da comoresultado un porcentaje de recuperación del 42 y 83% respectivamente, en el caso de las lipoproteínasno se aprecia ninguna diferencia significativa respectoal control (Tabla 1). Sin embargo, hay quetener en cuenta que el método de obtención de laslipoproteínas podría afectar los resultados, ya quela ultracentrifugación durante periodos de tiempotan largos puede ocasionar la alteración de su estructurao la formación de agregados.Figura 3. Porcentaje de recuperación de células conmembrana íntegra en función de concentraciones crecientesde proteínas plasmáticas.Tabla 1.- Efecto de las lipoproteínas de plasma seminal sobre la supervivencia de losespermatozoides ovinos obtenidos por “swim-up” y sometidos a choque térmico.% de espermatozoides con membrana íntegra700 µg 1300 µgt incubación control Lipoproteínas control lipoproteínas0 minutos 30,66 ± 4,98 33 ± 6,97 32 ± 3,25 31 ± 4,161 hora 27 ± 7,48 26,66 ± 5,24 25 ± 5,20 24 ± 6,31Por consiguiente, tras estos resultados es necesarioun fraccionamiento exhaustivo de las proteínasseminales para comprobar qué fracción o fraccionesson las responsables de este efecto reversor,con vistas a su aplicación en el mantenimiento dela capacidad fecundante en dosis dirigidas a inseminaciónartificial.CONCLUSIONESLas proteínas plasmáticas son capaces de revertir,al menos parcialmente, el daño producido por elchoque térmico por frío sobre espermatozoidesovinos obtenidos por “swim-up”, a diferencia delos separados del plasma seminal por filtración. Estopuede ser debido a que la filtración provoca ciertamodificación de la membrana espermática queimpide que las proteínas se adsorban y ejerzan suefecto reparador, o bien a la ineficaz eliminación dealgún factor inhibidor del mismo.La recuperación de la integridad de membrana esdependiente de la concentración de proteínas incorporadaal medio. La adición de la fracción lipoproteicadel plasma seminal no produce ningún efectosobre la integridad de la membrana del espermatozoidedañado por frío.AGRADECIMIENTOSEste trabajo fue financiado gracias a los proyectosDGA-P 03/96 y DGICYT AGF-97-0919. R.PÉREZ-PÉ disfruta de una beca D.G.A. y J.I.MARTÍ de una beca M.E.C.
REVERSIÓN DE LOS DAÑOS PRODUCIDOS POR FRÍO SOBRE LA MEMBRANA DE ESPERMATOZOIDESOVINOS. ESTUDIO MEDIANTE CCCD Y ENSAYOS DE VIABILIDAD CELULAR505REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICASAKERLUND, H. E.,1984. J. Biochem. Biophys.Methods, 9,.133-141.BRADFORD, M. M., 1976.. Analyt. Biochem.,72,248-254.DESNOYERS, L. P.; MANJUNATH, P.,1992.. JBiol Chem., 267, 10149-10155.DOTT, H. M.; HARRISON, R. A. P.; FOSTER, G.C. A.,1979. J. Reprod. Fert., 55, 113-124.GARCÍA-LÓPEZ, N.; OLLERO, M.; MUIÑO-BLANCO, T.; CEBRIÁN-PÉREZ, J.A., 1996..Theriogenology, 46, 141-151.GRAHAM, J. K., 1994.. Theriogenology, 41(5),1151-1162.HARRISON, R. A. P.;. Vickers, S. E ,1990. J.Reprod. Fert., 88(1); 343-352.KELLEY, J.L.; KRUSKI, A.W., 1986. Methods inEnzymology, 128, 170-181MANN, T. ,1964. The biochemistry of semen andof the male reproductive tract. Methuen, London.OLLERO, M.; GARCÍA-LÓPEZ, N.; PÉREZ-PÉ,R.; CEBRIÁN-PÉREZ, J.A; MUIÑO-BLANCO,T., 1997. Reprod. Fertil. Dev., 9, 381-90.SMITH, P. K.; KROHN, R. B.; HERMANSON, G.T., MALLIA, A. K.; GARTNER, F. H.; PRO-VENZANO, M. D.; FUJIMOTO; GOEKE, N.M.; OLSON, B. J.; Klenk, D. C., 1985.. Anal.Biochem., 150, 76-85.VREEBURG, J. T. M.; HOLLAND, M.K.; ORGE-BINCRIST, M.C., 1992. Biol. Reprod., 47, 588-597.WATSON, P. F., 1981. En: Effects of low temperatureson biological membranes, 189-218. Ed/Co.G. J. Morris and A. Clarke. Academic Press.London.
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