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508BARRIOS, B. et al.con el desarrollo de “epítopos” específicos como:el lugar de reconocimiento espermatozoide-oolema(Cameo et al., 1990) y la unión a la zona pelúcida“proteína P34H” (Boue et al., 1996). También, seadquieren proteínas inmunosupresoras para asegurarla supervivencia del esperma en el tracto genitalfemenino, “uteroglobina” (Brooks, 1990).Aunque se han descrito una importante cantidadde proteínas del plasma seminal, la función de lamayoría de ellas respecto a la fisiología del espermaes desconocida. Se han identificado dos proteínasdel plasma seminal, de 26kDa y 55kDa, y correlacionado( r= 0,89) con alta fertilidad en toros(Killian et al., 1993), y recientemente se ha descritoque las proteínas del plasma seminal cambian drásticamentelas características de superficie de losespermatozoides ovinos, pudiendo restituir la impermeabilidadde membrana después de haber sidosometidos a un daño térmico provocado (Ollero etal., 1997).El objetivo de este trabajo ha sido el aislamientode las proteínas del plasma seminal, tratando de analizarcuáles de ellas son responsables del efecto protector-reparadorde la membrana de los espermatozoidessometidos a choque térmico.MATERIAL Y METODOSSe utilizó semen ovino procedente de cuatromoruecos de raza Rasa aragonesa, obtenidomediante vagina artificial. El plasma seminal se eliminópor el procedimiento de swim-up/dextrano(García-López et al., 1996). Las muestras lavadasse sometieron a cold shock según el método citadopor Watson (1981) y se incubaron en presencia delas proteínas totales y las correspondientes fracciones,durante una hora a 20 o C.El plasma seminal se obtuvo siguiendo el protocolode Ollero et al. (1997) El filtrado obtenido seguardó hasta su uso a -20 o C. Para obtener las proteínasseminales se centrifugó el plasma seminal a3300xg, a 4ºC en microconcentradores Microsep de3 kDa de corte según Ollero et al. (1993). La concentraciónde proteínas se determinó mediante elmétodo de Bradford (1976).La viabilidad espermática (integridad de membrana)se determinó el método de Harrison y Vickers(1990). Los resultados se expresan como porcentajede células con la membrana integra, viables,en cada fracción.A partir de las células espermáticas sometidas achoque térmico, se separaron las subpoblaciónescontrol y ensayos, con una concentración aproximadade 10 6 células/ml (en medio mHTF) (García-López et al., 1996), determinándose los correspondientesvalores de viabilidad a t=0. Se añadieron700 µg de proteína a las muestras ensayo e inmediatamente,se incubaron a 20 o C durante 60 min,determinándose la viabilidad, cada 10 min.Purificación de proteínas a partir del plasmaseminal1- Cromatografía. La separación se llevo a cabomediante cromatografía en Gel, utilizando comomatrices Sephacril-100 SHR y Superdex 75. La eluciónde las proteínas se determinó mediante laabsorbancia a 280 nm y posterior cuantificación porBradford (1976).2- Densitometría. La determinación de las proteínasexistentes en cada subfracción se realizómediante electroforesis en SDS-poliacrilamida (7-22%) y su cuantificación mediante densitometríapor análisis de imagen (Gel-Doc).La visualización del daño de membrana asociadaal choque térmico se ha puesto de manifiestomediante microscopía electrónica de barrido.RESULTADOS Y DISCUSIONPara el desarrollo experimental realizado se hanutilizado plasmas seminales de ovino con contrastadacapacidad reversora del daño de membrana producidopor un choque-térmico. La tabla I muestraque el porcentaje medio del efecto reversor a los 60min. de incubación es de un 66 %. % reversión = [(Vp 60 -Vc 60 ) / (Vi-Vc 60 ) ] x 100.Tabla 1. Porcentaje de recuperación y valores de viabilidad ± error estandar. Vi viabilidad inicial, Vc-tviabilidad después del choque térmico, Vc viabilidad del control y Vp viabilidad muestra ensayo.Vi Vc-t Vc 0 Vp 0 Vc 60 Vp 60 % R66 ± 3 11 ± 1 15 ± 1 33 ± 3 18 ± 2 50 ± 3 66 ± 2