Descargar PDF (19.2Mb) - SEOC

536MARTÍ, J.I. et al.glucídicos de la superficie espermática. Dado quela abundancia y distribución de los receptores delectinas cambia durante la maduración epididimal,así como durante la capacitación y la reacción acrosómica(Nicolson, 1978; Guraya, 1987), resulta degran interés el estudio de los diferentes patrones demarcaje por las lectinas y su relación con ciertascaracterísticas celulares que suponen diferentesmodificaciones a nivel de la superficie espermática,como motilidad, viabilidad, estado de capacitacióny reacción acrosómica.La reacción acrosómica es un proceso de exocitosisque comprende múltiples fusiones entre lasmembranas acrosomal externa y la membrana plasmática,permitiendo la salida de enzimas y demáscontenido del acrosoma necesario para la fertilización(Yanagimachi, 1994). Esta reacción puedeinducirse de modo artificial con diversidad de sustancias,como por ejemplo el ionóforo de calcioA23187 (Pampiglione et al., 1993; Troup et al.,1994).Dado que la investigación de la función espermáticaha resultado ser de gran valor para la predicciónde la fertilidad del semen (Calvo et al.,1989; Benoff et al., 1993; Bielsa et al., 1994), elobjetivo de este trabajo ha sido el estudio de lainducción de la reacción acrosómica y su valoraciónmediante el marcaje con lectinas. Se ha puesto apunto un método de inducción de la reacción acrosómicacon ionóforo A23187 en semen ovino, sinla eliminación previa del plasma seminal. El procesose valoró determinando los diferentes patronesde tinción según el estado de viabilidad celular. Asímismo, se han comparado los patrones de marcajede la lectina de Ricinus communis (RCA 120 ) entreespermatozoides a los que se les ha inducido la reacciónacrosómica y los de la muestra control, y sehan analizado las relaciones entre estos resultadosy los obtenidos mediante la doble tinción de fluorescenciacon diacetato de carboxifluoresceina yioduro de propidio (CFDA/PI).MATERIAL Y MÉTODOSSe empleó semen ovino del segundo eyaculadode 3 moruecos de raza “Rasa Aragonesa” que semezclaron, con objeto de eliminar diferencias individuales.Las extracciones se realizaron mediantevagina artificial, a primera hora de la mañana. Lostubos colectores se mantenían en un baño de aguaa 37°C antes de la recogida y durante su traslado allaboratorio.Se provocó la reacción acrosómica sin la eliminaciónprevia del plasma seminal. Una alicuota de20 µl de semen se diluyó 1:200 en medio TALPmodificado (mT: NaCl 149 mM, KCl 2,5 mM,CaCl 2 3 mM, glucosa 10 mM y Hepes 20 mM, 318mOsm). Se separaron 500 µl para determinar la viabilidadinicial, mediante la doble tinción de fluorescenciacon diacetato de carboxifluoresceína yioduro de propidio (Harrison y Vickers, 1990). Estatécnica permite distinguir tres tipos celulares: viables,permeables al diacetato de carboxifluoresceínaque se tiñen de verde fluorescente debido a la hidrólisisde los grupos acetato por esterasas de la membrana;inviables, permeables al ioduro de propidioque se tiñen de rojo; e inviables con acrosomaintacto (región acrosómica de amarillo y postacrosómicade rojo). Se indujo la reacción acrosómicaañadiendo a 498,3 µl de muestra 1,7 µl de ionóforoA23187 0,34 µM (C-7522, Sigma Chemical Co.)en dimetilsulfóxiddo (DMSO) (C-7522, Sigma ChemicalCo.). En la muestra control el ionóforo se sustituyópor igual volumen de DMSO. Las muestrasse mantuvieron en un baño de agua a 39°C durante1 hora con agitación.La inducción de la reacción acrosómica se evaluódeterminando, antes y después de la incubación, laintegridad de la membrana acrosomal mediante ladoble tinción de fluorescencia. Aquellos espermatozoidescon fluorescencia verde en sus acrosomasse consideraron como no reaccionados, mientras quelos espermatozoides que habían sufrido la reacciónacrosómica presentaban las cabezas rojas. Es deresaltar que en este grupo también estarán los espermatozoidesque ya estuvieran muertos inicialmentey aquellos que hayan sufrido la reacción acrosómicaespontánea durante la incubación.Con el objetivo de conocer las glicoproteínas dela superficie celular que intervienen en el reconocimientoentre el espermatozoide y el ovocito, paralelamentese llevó a cabo un ensayo de marcaje delectinas comparativo entre espermatozoides de lamuestra control y de la muestra en la que se indujóla reacción acrosómica. Para este estudio se utilizaron5 lectinas conjugadas con isotiocianato defluoresceina (FITC) del kit de Vector 2100 (VectorLaboratories, Peterborough, Cambs). La tinción conlas lectinas se realizó añadiendo una concentraciónfinal de 5 µg/ml de RCA a 7µl de una suspensiónde espermatozoides (10 5 células), incubando 3minutos en oscuridad a temperatura ambiente. Acontinuación, se depositaron 5 µl entre porta ycubre. Con microscopio óptico de campo claro serealizó el recuento total de espermatozoides, y almicroscopio con iluminación epifluorescente (Nikon