MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt B
Funktionelle und Strukturelle Genomforschung
DNA-Flexibilität auf multiplen Größenskalen
F. Lankas, J. Langowski
In Zusammenarbeit mit Jiri Sponer (Universität Brno) und Thomas
A. Cheatham III (University of Utah)
Die mechanische Verformbarkeit der DNA spielt eine wichtige
Rolle bei vielen biologischen Prozessen wie DNA-Protein-
Wechselwirkung, Chromatinkompaktierung und der räumlichen
Organisation des Genoms im Zellkern. Die Art der
Deformation hängt von der Längenskala ab: beispielsweise
ist die spezifische Bindung von Proteinen an DNA direkt
mit den strukturellen und mechanischen Eigenschaften von
konformationellen Unterzuständen der Nukleinsäure verknüpft.
Auf größeren Längenskalen kann die gesamte DNA
als flexible Kette durch Parameter wie die Biege- und
Torsionsflexibilität beschrieben werden [3,9,15,29], und
schließlich kann die Chromatinfiber selbst als flexibles Filament
angenähert werden [28].
Bis zu einer Länge von 10-20 Basenpaaren sind molekulardynamische
Simulationen der DNA in atomarer Auflösung
unter expliziter Einbeziehung von Gegenionen und Wasser
möglich. Eine Reihe solcher Simulationen haben wir mit
dem Programmsystem AMBER auf den Hochleistungsrechnern
des DKFZ durchgeführt und Trajektorien von 5-10 ns
Länge mit verschiedenen Methoden analysiert. Hierbei untersuchen
wir einerseits mögliche konformationelle Unterzustände
der DNA, sowie die Fluktuationen von
Konformationsparametern für die Berechnung der sequenzabhängigen
Flexibilität. Im allgemeinen finden wir eine erhöhte
Flexibilität für Pyrimidin-Purin-Schritte. Eine
Korrelationsanalyse der strukturellen Fluktuationen zeigte
auch, dass die DNA-Flexibilität nicht nur von den direkten
Nachbarn eines Basenpaars abhängt, sondern dass weiter
reichende Effekte (bis zu 3-4 Basenpaaren) eine Rolle spielen
[1,17,30].
Modellierung der 30nm-Chromatinfiber
F. Aumann, F. Lankas, K. Klenin, J. Langowski
In unserem Computermodell der Chromatinfiber wird die
DNA durch eine Kette von zylinderförmigen Segmenten
dargestellt, auf der die Nukleosomen in regelmäßigen
Abständen als flache Zylinder repräsentiert sind. Die Nukleosomen
wechselwirken miteinander über ein schwach
anziehendes Potential; die elektrostatische Wechselwirkung
der DNA-Segmente wird in der Debye-Hückel-Näherung
dargestellt. Konfigurationen der Polynukleosomenkette im
thermodynamischen Gleichgewicht werden dann durch
einen Metropolis-Monte Carlo-Algorithmus erzeugt. Das Simulationsprogramm
wurde in C++ optimiert für parallele
Rechnersysteme entwickelt.
Simulationen von 100 Nukleosomen langen Ketten bei
physiologischer Ionenstärke führen zu Strukturen, die die
experimentell bekannten Eigenschaften von Chromatinfibern
wie Durchmesser, Massenbelegungsdichte und Neigungswinkel
der Nukleosomen zur Fiberachse gut reproduzieren.
Besonders bemerkenswert ist, dass die simulierte
Chromatinfiber eine spiralförmige Struktur hat, d.h., der
äußere Aspekt ist ähnlich dem Solenoidmodell, wobei aber
anders als bei letzterem keine starke Krümmung der Linker-DNA
zwischen Nukleosomen notwendig ist [2].
Simulationen zur Streckung der kondensierten Chromatinketten
zeigen ein qualitativ ähnliches Verhalten im Vergleich
mit experimentellen Daten [Bennink et al. 2001, Nat Struct
Biol 8(7):606-10] und geben Aufschluss über eventuelle
Abteilung B040
Biophysik der Makromoleküle
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
geometrische Veränderungen der Chromatinkette bei der
Streckung. Die aus den simulierten Streckexperimenten
berechneten Elastizitätsparameter zeigen, dass die Chromatinfiber
gegenüber Verbiegung deutlich flexibler ist als
gegenüber Streckung.
Flexibilität von Hefechromosomen
L. Gehlen, J. Langowski
In Zusammenarbeit mit Kerstin Bystricky und Susan Gasser,
Universität Genf, Schweiz
Hefe ist wegen des kleinen, gut charakterisierten Genoms
ein ideales Modellsystem zur Untersuchung der Genomdynamik.
In der Arbeitsgruppe von Prof. Susan Gasser (Uni Genf)
ist die Dynamik von Chromosomen in Hefe unter Anwendung
verschiedener Fluoreszenztechniken auf Zeitskalen
von Zehntelsekunden bis hin zu Minuten untersucht worden.
Im Rahmen dieser Zusammenarbeit wurde die Methode
der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS, siehe
unten) eingesetzt, um die Beweglichkeit von Hefechromosomen
auf kurzen Zeitskalen zu untersuchen. Dies sind die
ersten bisher beschriebenen FCS-Messungen in Hefezellen.
Zunächst wurde anhand der Diffusion von freiem GFP die
Anwendbarkeit der Messmethode auf Hefezellen und ihre
Kerne untersucht. Die spezifische Bindung eines mit GFP
fusionierten Repressorproteins an einen DNA-Abschnitt
wurde ausgenutzt, um die Bewegung von Chromosomen
zu beobachten. Nach Anpassung einer Modellfunktion mit
zwei Spezies konnten signifikante Unterschiede zwischen
Zellen mit markiertem Chromosom und solchen, die nur
den freien Repressor enthalten, festgestellt werden. Die
Unterschiede liegen in der Diffusionszeit und der Amplitude
einer langsamen Komponente, die von der Bewegung der
Chromosomenarme herrührt.
Um die Daten theoretisch zu untermauern, wurde unser
Brownsche-Dynamik-Simulationsprogramm auf die Modellierung
der 30nm-Chromatinfiber umgestellt und um Funktionen
zur Simulation von Chromatin im Zellkern und die Bindung
des Zentromers an den spindle pole body erweitert.
Erste Ergebnisse der Simulation von Hefechromosomen deuten
darauf hin, dass sich durch den Vergleich mit experimentellen
Resultaten zwischen verschiedenen diskutierten Parametersätzen
für die mechanischen Eigenschaften von Chromatin
unterscheiden lässt [Gehlen, Diplomarbeit, Fak. für
Physik, Uni Heidelberg; Bystricky et al. 2004 PNAS, eingereicht].
Geometrie der Linker-DNA in Mononukleosomen
- Effekt der Histonacetylierung
K. Tóth, N. Brun, J. Langowski
Die Struktur des Grundbausteines von Chromatin, des
Nukleosoms, ist seit einiger Zeit in atomarem Detail bekannt.
In der Chromatinfiber ist die DNA in regelmäßigen
Abständen um Histonoktamere gewunden; wie die so gebildeten
Nukleosomen dreidimensional zu einer übergeordneten
Struktur arrangiert sind, ist jedoch noch nicht geklärt.
Wir versuchen hier, durch Untersuchungen der DNA-Struktur
in der Nähe des Histonkerns Aussagen über solche Strukturen
zu gewinnen. Dazu werden Nukleosomen auf DNA-
Fragmenten von 150-220 bp Länge rekonstituiert, die an
den Enden mit jeweils einem Donor- und einem Akzeptor-
Fluorophor markiert sind. Nach Bindung der DNA an den
Histonkern wird durch FRET der mittlere Abstand zwischen
den Fluorophoren als Funktion der DNA-Länge, der Salz-