MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
Integriert:
V290: Wissenschaftlicher Service:
Analytische Mikroskopie und Mikroinjektion
Konfokale- und Videomikroskopie
Mikroinjektion
Analytische Elektronenmikroskopie in Zell- und
Molekularbiologie
Wissenschaftliche Mitarbeiter
Dr. Herbert Spring
Dr. Karin Schwab ( - 8/02)
Dr. Marco Marcello (8/02 - 12/04)
Dr. Helmut Tröster (1 - 5/04)
Technische Mitarbeiter
Roger Fischer
Gastwissenschaftler
Prof. Dr. Luiz H. Monteiro Leal (3/01 - 2/02)
Dr. Aurora Marques Cianciarullo (8/01 - 4/02)
Dr. Marcelo Pelajo Machado (1 - 12/02)
Loraine Campanati Araujo (9/01 - 2/02)
Sekretariat
Rosemarie Pflüger (¼; 1/03 - 1/04)
A120
Strukturelle Genanalyse
Zentrale Arbeitsgruppe Biomedizinische Strukturforschung
Strukturelle Genanalyse (A120)
Leiter: Prof. Dr. Michael F. Trendelenburg
1993 wurde am DKFZ eine Zentrale Arbeitsgruppe Biomedizinische
Strukturforschung eingerichtet, die im Bereich
der modernen licht- und elektronenmikroskopischen
Verfahren die Abteilungen des DKFZ unterstützt.
Ein - begrenztes - Service-Angebot (V 290) der Gruppe
besteht für folgende Gebiete:
Konfokale Laserscan Mikroskopie, Videomikroskopie, Automatisierte
Mikroinjektion, Elektronenspektroskopische
Strukturanalysen im Nanometer-Bereich durch Elektron
Spectroscopic Imaging (ESI).
Videomikroskopie und konfokale Mikroskopie erlauben
durch die Kombination molekularbiologischer und optischer
Detektionsverfahren sowie der Digitalisierung der
Bilder eine vielseitige rechnergestützte Auswertung inklusive
3D-Rekonstruktion.
Die konfokale Technik ermöglicht eine Erweiterung der
Bildinformation auf einen in der Z-Achse definierbaren
Focusbereich, der im Sub-Mikrometer-Bereich liegt.
Durch Bewegen des Präparats in der optischen Achse
sowie durch Unterdrückung der nicht zur Fokusebene
gehörenden Bildinformationen durch die sogenannte
konfokale Blende werden lichtoptische Schnittserien vom
Objekt im Fluoreszenzverfahren möglich, ohne dieses zu
beeinträchtigen. Über die computergestützte Rekonstruktion
wird dann z.B. ein 3-dimensionales Bild des Objektes
errechnet. In Verbindung mit Mehrfach-Fluoreszenzmarkierungen
und simultaner Detektion kann auf
diese Weise die räumliche Struktur intrazellulärer Kompartimente
sichtbar und quantifizierbar gemacht werden.
Darüberhinaus ermöglicht diese Technik auch einen Einblick
in relativ „dicke“ mikroskopische Präparate wie beispielsweise
Zellverbände, Eizellen oder Embryonen.
Bedingt durch den raschen Ausbau der GFP (green fluorescent
protein) Technologie hat sich die Mikroskopie
mehrfach Fluoreszenz markierter lebender Zellen rasch
etablieren können: FLIM (fluorescence live cell imaging
microscopy). Hierdurch können komplexe intrazelluläre
Assembly Prozesse in ihrem charakteristischen räumlich-
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
zeitlichen Ablauf dokumentiert und experimentell analysiert
werden. Die derzeit überwiegend eingesetzte Fluoreszenz
Mehrfach Markierungs-Strategie stellt erheblich
erweiterte Anforderungen an die konfokale Detektion:
Das in unserer Gruppe installierte ZEIISS LSM 510 META
System erlaubt eine sehr gute spektrale Analyse der eingesetzten
Fluoreszenz Marker, da lediglich die charakteristischen
Hauptmaxima ausgewertet und zum Aufbau des
digitalern Bildes verwendet werden, d.h. ohne die zum
Teil erheblichen Beiträge des „cross-talks“ überlappender
Fluoreszenzspektren, welche ein Charakteristikum vieler
Typen von Mehrfach Markierungsexperimenten sind.
Das mit der Lichtmikroskopie eng verbundene Gebiet der
automatisierten Mikroinjektion ermöglicht einen gezielten
Transfer unterschiedlichster Proben (bei kleinsten Probenvolumina)
je nach Experimenttyp in das Cytoplasma
oder den Zellkern adhärenter lebender Gewebekulturzellen.
In Verbindung mit den beiden zuvor genannten
Techniken ist die Mikroinjektion ein elegantes Verfahren
zum Studium komplexer Regulations- und Transportvorgänge
auf zellulärer Ebene.
Im Jahr 1995 wurde zusätzlich eine Serviceeinheit „Analytische
Elektronenmikroskopie für Biomedizinische Proben“
eingerichtet (Förderung durch das BMBF Programm
Biotechnologie 2000: Projektgerät ZEISS/LEO EM 912,
mit Omega Energiefilter). In enger Zusammenarbeit mit
anderen Abteilungen des DKFZ wurden sowohl Probenvorbereitung
als auch Analyseparameter dieser neuartigen
Spektroskopie-Technik soweit optimiert, dass ein
Einsatz dieses hochauflösenden Analyseverfahrens in weiten
Gebieten der molekularen Biomedizin möglich wird.
Parallel hierzu werden neuartige molekulare Markierungstechniken
für diesen Anwendungsbereich entwickelt.
Seit Dezember 2003 wurde das 2. BMBF Projektgerät:
ZEISS/LEO SESAM 1 (Sub-Electronvolt-Sub-Angström
Microscope) mit dem derzeit leistungsfähigsten Energiefilter:
einem 90 Grad Omega Filter installiert.