MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt B
Funktionelle und Strukturelle Genomforschung
Funktionelle Genomanalyse
J.D. Hoheisel, V. Aign, T. Beißbarth, K. Fellenberg,
R. Fleischer, M. Frohme, A. Jacob, Z. Li, T. Pulli,
M. Scheideler, Y. Syagailo, D. Zubakov, N. Hauser,
S. Marsal Barill, R. Martinez, J. Pullat, J. Salgado,
M. Valle, O. Witt, A. Bauer, B. Beckmann, J. Beigel,
A. Boerner, O. Brandt, S. Brems, C. Busold, Y.-P. Lin,
S. Grahlmann, V. Hollich, T. Korica, W. Kusnezov,
A. Petersohn, M. Schanne, D. Stjepandic, E. Ullu,
S. Würtz
In Kooperation mit: H. Arlinghaus, Universität Münster; J.
Arnold, University of Georgia, Athens, USA; M. Beier, Febit,
Mannheim; N. Becker, DKFZ; K. Berlin, Epigenomics, Berlin; A.
Brown, Universität Aberdeen, UK; S. E. Celniker, Lawrence Berkeley
National Laboratory, Berkeley, USA; C. Clayton, ZMBH,
Universität Heidelberg; K. Dekker, MPI für Züchtungsfoschung,
Köln; R. Frank, GBF, Braunschweig; H. Friess, Universität Heidelberg;
E. Furlong, EMBL, Heidelberg; T. Gress, Universität Ulm; M.
Harder, Merck, Darmstadt; M. Hecker, Universität Greifswald; M.
Hrabé de Angelis, GSF, München; V. de Lorenzo, Centro Nacional
de Biotecnologia, Madrid, Spanien; Frank Lyko, DKFZ; M. von
Knebel-Döberitz, Universität Heidelberg; W. Mewes; GSF,
München; A. Metspalu, Universität von Tartu, Estland; M. Nees,
Universität Heidelberg; Karen Nelson, TIGR, Rockville, USA; S.
Oliver, Universität Manchester, UK; R. Paro, ZMBH, Universität
Heidelberg; A. Pühler, Universität Bielefeld; F. Sauer, ZMBH,
Universität Heidelberg; M. N. Schlaich, RWTH Aachen; M.
Schnölzer, DKFZ; U. Schulte, Universität Düsseldorf; A. Simpson,
Ludwig Institut; Sao Paulo, Brasilien; B. Tümmler, Medizinische
Hochschule Hannover; E. de Villiers, DKFZ; M. Vingron, MPIMG,
Berlin; S. Volinia, Universität von Ferrara, Italien; und vielen
anderen.
DNA-Microarray/DNA-Chip Technologie
Mit der Entschlüsselung der vollständigen Sequenzinformation
in einer Vielzahl von Organismen werden experimentelle
Verfahren zur Analyse der zellulären Umsetzung der dort
kodierten Information essentiell für weiterführende, funktionelle
Studien. In den letzten Jahren hat sich die DNA-
Chip Technologie zu einem wichtigen Werkzeug für solche
Untersuchungen entwickelt. Über Modifikationen des
grundlegenden Ansatzes sind viele, verschiedene Anwendungen
möglich.
Technische Entwicklungen zur Herstellung hochqualitativer
Microarrays
Für chip-basierende Analysen werden unterschiedliche Microarray-Systeme
verwendet, die als Sensormoleküle entweder
Oligonukleotide oder lange DNA-Fragmente tragen.
In der Herstellung unterscheiden sie sich noch dadurch,
ob Oligomere in situ synthetisiert werden oder DNA (Oligomer
oder PCR-Produkt) als vorgefertigtes Fragment aufgebracht
werden. Verschiedene Aspekte der Herstellung,
die die Qualität der DNA-Microarrays maßgeblich beeinflussen,
wurden untersucht und verbessert.
Fotolithografische Produktion von Oligonukleotid-
Chips
(BMBF finanziert)
Die Qualität der Oligonukleotide auf einem DNA-Chip hat
immense Konsequenzen auf die Genauigkeit, Sensitivität
und Messdynamik von Microarray Analysen. Die Qualität der
fotolithografischen in situ Synthese hängt von der Effizienz
der Fotoentschützung ab. Mittels eines neu entwickelten
Prozesses konnte unter Ausnutzung von 5'-[2-(2-Nitrophenyl)-Propyloxycarbonyl]-2'-DeoxynucleosidePhosphoramiditen
die schrittweise Syntheseausbeute im Vergleich zu
bestehenden Verfahren wesentlich verbessert werden.
Außerdem wurden fotolabile 3'-O-[2-(2-Nitrophenyl)-Prop-
Abteilung B070
Funktionelle Genomanalyse
oxycarbonyl]-geschützte 5'-Phosphoramidite hergestellt.
Aufgrund ihrer einzigartigen Charakteristik kann die lichtgesteuerte
in situ Oligonukleotid-Synthese auf dem Chip in
5'-3' Richtung erfolgen. Dadurch sind die Oligonukleotide
auf dem Chip invers ausgerichtet, wodurch ihre 3'-Enden
als Substrat für nachfolgende Polymerasereaktionen dienen
können.
Produktion von DNA-Microarrays mit hoher Homogenität
der Belegpunkte und geringem Hintergrundsignal
aus unaufgereinigten PCR-Produkten
(BMBF finanziert)
In Analysen auf DNA-Microarrays, die durch das Aufbringen
(“spotting”) vorgefertigter DNA-Fragmente entstehen,
spielt die Qualität der Belegpunkte und die Stärke des
Hintergrundsignals auf dem Glasträger eine wichtige Rolle.
Durch den Zusatz von Betaine wurde die Bindungseffizienz
und die Homogenität der Belegpunkte wesentlich verbessert.
Zusätzlich konnte das unspezifische Hintergrundsignal
stark verringert werden, indem die Blockierung der Aminogruppen
auf der Chip-Oberfläche mit Succinylanhydrid durch
die Gegenwart des unpolaren, nicht-wässrigen Lösungsmittels
1,2-Dichloroethan und des Katalysts N-Methylimidazol
verbessert wurde. Mittels dieses Verfahrens konnte auch
die aufwendige Aufreinigung der PCR-Produkte vor dem
Aufbringen uaf die Microarray-Oberfläche vermieden werden,
wodurch auch etwa doppelt so viele der teuren Microarrays
produziert werden können.
Herstellung und Nutzung komplexer Oligonukleotid
Microarrays aus licht-kontrollierter in situ Synthese
In Kooperation mit der Firma febit, nutzen wir als β-Testpartner
das Geniom-Gerät zur Herstellung komplexer Oligonukleotid-Microarrays.
Durch die Kombination mit unseren Entwicklungen
auf dem Gebiet licht-gesteuerter Oligomersynthese
(s.o.), sind eine Vielzahl verschiedener Anwendungen
möglich, wie etwa Untersuchungen von Transkriptmengen,
Studien im Bereich molekulare Epidemiologie und Genotypisierung,
Typisierung von HPV-Viren und die Durchführung
enzymatischer Reaktionen direkt auf dem Chip.
Markierungs- und amplifikationsfreier Nachweis
von Hybridisierexperimenten auf “Peptide Nucleic
Acids” (PNAs)
(BMBF finanziert)
Die Verwendung von PNA-Oligomeren als Chip-gebundene
Sensor-Moleküle wurde in der Abteilung entwickelt. Die
vollautomatische, parallele Synthese von mehreren Tausend
PNA-Molekülen wurde im Labor etabliert. Des weiteren existieren
Methoden zur Aufreinigung der Moleküle und Herstellung
hoch-dichter PNA-Chips. Da PNA-Synthese chemisch
betrachtet eine Peptid-Synthese darstellt, lassen sich diese
Verfahren auch für die Herstellung komplexer Peptid-Chips
nutzen. Im Vergleich zu DNA-Oligonukleotiden hat PNA wesentliche
Vorteile. Vor allem lässt sich die Bindung von Nukleinsäuremolekülen
direkt - markierungsfrei und ohne Amplifikation
des Ausgangsmaterials - über die Phosphatgruppen
massenspektrometrisch nachweisen, da PNA keine Phosphatgruppen
besitzt. In einem Nachfolgeprojekt wird in
Zusammenarbeit mit drei Firmen jetzt an der Entwicklung
eines Prototypen gearbeitet
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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