MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
A125
Modellversuche zur Invasion und Metastasierung
Modellversuche zur Tumorinvasion und Metastasierung (A125)
Leiter: Prof. Dr. Eberhard Spiess
Technische Angestellte
Anna Heckel-Pompey (½) ( - 7/03)
Die Gruppe hat sich mit technischen Problemen der lebend-Zell-Mikroskopie
und dem Einfluss von Proteinen
auf den Zelltod beschäftigt.
In Zusammenarbeit mit: Dr. T.A. Knoch, Prof. Dr. D. Werner,
DKFZ; Felix Bestvater febit AG, Mannheim; Prof. Dr. H. Acker,
MPI für Molekulare Physiologie, Dortmund, PD Dr. T. Feurer,
Institut für Quantenphysik und Optik, FSU, Jena; Dr. S. Gil-
Parrado, Institut für Klinische Chemie und Biochemie LMU,
München.
„Gene Walking“ bei Transfektionsexperimenten
Zum Studium zellulärer Prozesse in vivo werden in den letzten
Jahren als Reporter verschiedene Varianten des Grün-
Fluoreszierenden-Proteins (GFP) eingesetzt, die mit dem
eigentlichen Zielmolekül in einem Genkonstrukt verbunden
sind. Diese GFP Varainten sind in ihren Sequenzen fast identisch.
Wir haben bei Ko-transfektionen von Genkonstrukten,
die mit unterschiedlichen GFP Varianten markiert sind, festgestellt,
dass es zu falsch positiven Ergebnissen kommt.
Unter Standard Bedingungen waren bis zu 8 % und unter
bestimmten Umständen bis zu 26% der exprimierenden
Zellen betroffen. Solche Abweichungen beeinträchtigen
die Interpretation der Versuche erheblich. Systematische
Untersuchungen zeigten, dass das Phänomen auf einer
homologen Rekombination der DNA beruht, die auf der
hohen Homologie in den GFP Sequenzen basiert.
Dieses „Gene Walking“ hat jedoch auch positive Aspekte:
mit quantitativen Auswertungen sind Rückschlüsse möglich
auf Prozesse der Replikation-Rekombination-Reparatur
(RRR) von DNA, die in Tumorzellen gestört sein können.
Darüber hinaus ist die Methode ein eleganter und einfacher
Ansatz zur Neukonstruktion von GFP-Fusionsproteinen.
[1]
Zwei Photonen Spektren von biologisch relevanten
Fluorochromen
Zwei- bzw. Mehr-Photonen Mikroskopie gewinnt aufgrund
mehrer technischer Vorzüge zunehmend Bedeutung in der
bio-medizinischen Forschung. Spektren von Fluorochromen,
die auf unterschiedliche Anregungsart erzeugt werden,
müssen aus theoretischen Gründen nicht notwendigerweise
identisch sein. Deshalb ist grundsätzlich für jedes Fluorochrom
eine Vermessung in jedem Anregungsmodus notwendig.
Solche Messungen für biologisch relevante
Fluorochrome lagen bislang für Zwei-Photonen-Anregung
nicht vor. Wir haben deshalb Spektren vieler gebräuchlicher
Fluorochrome vermessen, wie z.B. Acridin Orange,
DAPI; Hoechst 33342, FITC, Rhodamin, Cy2, Cy3. In der
Tat kommt es zu Abweichungen zwischen Ein- und Zwei
Photonen Anregungs Spektren, die bei der Excitation in
der Regel blau, bei der Emission in der Regel rot verschoben
sind. Dies gilt auch für die später vermessenen Varianten
des Grün Fluoreszierenden Proteins (ECFP, EGFP, EYFP).
[2, 3]
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
Funktion von Calpain
Calpaine sind Proteasen, die wiederholt mit Apoptose Prozessen
in Verbindung gebracht worden sind. Der zugrunde
liegende Mechanismus ist jedoch weitgehend unbekannt.
Wir untersuchten den Ionomycin-modifizierten
Zelltod, der sich durch synthetische und natürliche Inhibitoren
von Calpain hemmen lies. Die Abnahme von BiD
und Bd2 im Verlauf der Apoptose ist durch Calpain beeinflussbar,
in vitro kann Calpain die an apoptotischen Prozessen
beteiligten Caspasen 9, 3 und 7 aktivieren und Bd-2,
BiD und Bcl xl spalten. Diese Spaltprodukte können aus
isolierten Mitochondrien Cytochrom c frei setzten. Wir
schlossen daraus auf einen Einfluss des aktivierten Calpain
auf eine Auslösung bestimmter apoptotischer Wege. Der
Aktivierungsprozess selbst wird durch eine Membranbindung
des Calpains eingeleitet. [4, 5]
Lokalisation von Prothymosin α
Prothymosin α (PTα) ist ein weitverbreitetes, extrem
saueres Protein (das sauerst bekannte überhaupt), das
entgegen anfänglicher Annahmen keine Verwandtschaft
mit Thymosin hat. In seiner 110 Aminosäuren langen Sequenz
ist ein Kern-lokalisations-Signal (NLS) enthalten. Über
seine Lokalisation, Funktion und über mögliche Interaktionspartner
ist wenig bekannt. Es wird mit Zellteilungs- und
Zelltot-Prozessen in Verbindung gebracht. Wir untersuchten
Lokalisation und Transport des PTα in normalen Zellen
und in Tumorzellen in vivo mit Hilfe einer transfizierten PTα-
EGFP Chimäre. In zeitlich ausgedehnten Lebendbeobachtungsstudien
wurde gezeigt, dass PTα sich zwischen Cytoplasma
und Zellkern hin und her bewegt. Die Freisetzung
aus dem Kern ist ein schneller Prozess (Sekunden), der
umgekehrte Weg verläuft über Stunden. Das für diese
Vorgänge notwendige Transportsystem ist noch unbekannt.
In bestimmten Tumorzelllinien führte eine Überexpression
des PTα zu einem raschen Zelltod. Dies bestätigt ander
Untersuchungen, dass PTα in apoptotische Kaskaden involviert
ist.
Publikationen (* = externer Koautor)
[1] Bestvater, F., Knoch, T.A., Langowski, J., Spiess, E. (2002)
Construct conversions caused by simultaneous cotransfection:
„GFP-Walking“. BioTechniques 32, 844-855.
[2 ] Bestvater, F., Spiess, E., *Stobrawa, G., *Hacker, M.,
*Feurer, T., *Porwol, T., *Berchner-Pfannschmidt, U., *Wotzlaw,
C., *Acker, H. (2002) Two-photon fluorescence excitation and
emission spectra of dyes relevant for cell imaging. J. Microscopy
(Oxford) 208, 108-115.
[3 ] Zusätzlich Publiziert über: http://www.omegafilters.com/
front/curvomatic/spectra.php
[4] *Gil-Parrado, S., *Fernández-Montalván, A., *Assfalg-
Machleidt, I., *Popp, O., Bestvater, F., *Holloschi, A., Knoch,
T.A., *Auerswald, E. A., *Welsh, K., *Reed, J.C., *Fritz, H.,
*Fuentes-Prior, P., Spiess, E., *Salvesen, G., *Machleidt, W.
(2002) Ionomycin-activated calpain triggers apoptosis: A probable
role for Bcl-2 family members J. Biol. Chem. 277, 27217 –
27226.
[5] *Gil-Parrado, S., *Popp, O., Knoch, T.A., *Zahler, S.,
Bestvater, F., *Felgenträger, M., *Holloschi, A., *Fernández-
Montalván, A., *Auerswald, E.A., *Fritz, H., *Fuentes-Prior, P.,
*Machleidt, W., Spiess, E. (2003) Subcellular localization and in
vivo subunit interactions of ubiquitous-calpain. J Biol Chem. 278,
16336-46.