MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt F
Infektion und Krebs
Mechanismen der antitumoralen Wirkung von
Typ I IFN
R. Zawatzky, H. Wurmbaeck und A. Weyland
In Kooperation mit Prof. Dr. Männel, Patholog. Institut, Universität
Regensburg; Dr. Kroeger und Dr. Hauser, Abt. Genregulation
und Differenzierung, GBF Brunschweig; Dr. Fournier und
Prof. Dr. Schirrmacher, Abt. Zelluläre Immunologie, DKFZ
Unmethylierte CpG-Dinukleotidhaltige DNA Sequenzen sind
starke Immunstimulantien und induzieren in antigenpräsentierenden
Zellen und Makrophagen eine breitgefächerte
Zytokinantwort, die auch zur Aktivierung von Th1 Zellen
führt. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof.
Dr. Männel untersuchten wir in einem Tumormodell der
Maus die antimetastatische Wirkung von CpG-ODN Injektionen.
Wir konnten zeigen, dass CpG-ODN grosse Mengen
IFN-α im Serum induziert und zur Aktivierung von NK-Zellen
führt. Die Absiedelung von Mikrometastasen in der Lunge
- ermittelt drei Tage nach Gabe von Tumorzellen - war in
CpG-ODN behandelten Mäusen um mehr als 90% verringert.
In syngenen TypI IFN receptor (IFNAR1) defizienten Mäusen
dagegen hatte die CpG-ODN Behandlung keinen Effekt.
Diese Ergebnisse belegen die Bedeutung von TypI IFN als
essentieller Bestandteil der angeborenen Immunabwehr.
In weiterführenden Versuchen wollen wir untersuchen,
inwieweit das IFN-System auch an der Entwicklung von
langlebigen tumorspezifischen Gedächtnis-T-Zellen beteiligt
ist. Diese Untersuchungen sollen zum einen an Hepa1-6
Lebertumoren der Maus vorgenommen werden, die durch
eine induzierbare IRF-1 Expression selbst IFN-β sezernieren.
Diese Studien laufen in Kooperation mit Dr. Kroeger und
Dr. Hauser an der GBF.
Zum andern wollen wir in Zusammenarbeit mit Dr. Fournier
und Prof. Dr. Schirrmacher die tumorspezifische Immunantwort
gegen ESb Lymphome in IFNAR-defizienten und Wildtyp
Mäusen vergleichen. Auch hier gilt unser besonderes
Interesse der Frage, ob ein intaktes IFN-System für die Entwicklung
von ‚Memory’ T-Zellen essentiell ist.
Molekulare und biochemische Charakterisierung
des IFN-induzierten Gens IFRG28
M. Klehr, A. Weyland, H. Wurmbaeck und R. Zawatzky
Die pleiotropen Wirkungen der Typ I Interferone (IFN) werden
durch eine Vielzahl spezifischer Gene vermittelt, die in
ihrem Promotorbereich ein oder mehrere „Interferon-Stimulated-Response-Elements“
(ISRE) tragen. An diese ISRE
binden Komplexe verschiedener Transkriptionsfaktoren, die
im Zuge der Signaltransduktion nach Bindung von IFN an
den aus zwei Ketten bestehenden spezifischen IFN-Rezeptor
in den Zellkern gelangt sind und aktivieren die Transkription
dieser Gene.
Wir haben durch ein differentielles Screening eine weitere
IFN-induzierbare mRNA in primären Makrophagen von Mäusen
identifiziert und benannten sie vorläufig 3/7. Das offene
Leseraster besteht aus 747 bp und kodiert für 249 Aminosäuren.
Die Struktur des entsprechenden Gens wurde entschlüsselt
und die Aktivität des Promotors untersucht [3].
Die cDNA wurde außerdem in verschiedenen Zellsystemen
zur Expression gebracht und mit Hilfe des rekombinanten
GST-Fusionsproteins wurden polyklonale und monoklonale
Antikörper erzeugt. Expressionsanalysen auf mRNA Ebene
zeigten eine rasche Induktion durch IFN-α nach bereits
einer Stunde in allen untersuchten Zellinien. Das 3/7 Gen
besteht aus zwei Exons und hat eine Größe von 3.8 kb
Abteilung F030
Virale Transformationsmechanismen
vom Transkriptionsstart bis zum Polyadenylierungssignal. Die
ersten 230 Nukleotide der flankierenden Sequenz am 5’
Ende - berechnet vom Transkriptionsstart - besitzen drei
ISRE sowie ein „Gamma-Activated-Sequence“ (GAS) Element.
Promotoranalysen mit Hilfe von Luciferase-Reporter
Konstrukten zeigten, dass nach IFN-α Stimulation der
transfizierten Zellen jedes der drei ISRE allein funktionell
aktiv ist und inaktive Mutanten aller ISRE zu einem vollständigen
Verlust jeglicher Promotoraktivität führen. Mit Hilfe
der verschiedenen Antikörper wird z.Zt. die Expression des
Proteins nach Stimulation mit verschiedenen Zytokinen bzw.
nach Virusinfektion in vivo untersucht. Mit Hilfe von Immunpräzipitationen
und GST-Pull-Down Experimenten sollen mögliche
Interaktionspartner des Proteins in Zellextrakten und
Kulturüberständen von IFN-α behandelten Zellen identifiziert
werden, um weiteren Aufschluß über die physiologischen
Funktionen des Proteins bei Immunreaktionen zu
erhalten. Durch eine Datenbank-unterstützte Suche stießen
wir kürzlich auf eine cDNA identischer Sequenz (Acc.No.
AJ251364) und übernahmen für unsere cDNA die neue
Bezeichnung IFRG28.
Publikationen (2002-2003) (* = externer Koautor)
[1] Bachmann, A., Zawatzky, R., Soto, U., van Riggelen, J., zur
Hausen, H. und Rösl, F. (2002) Disturbance of tumor necrosis
factor alpha-mediated beta interferon signaling in cervical carcinoma
cells. J. Virol. 76: 280-291.
[2] Kirchhoff, S., Sebens, T., Baumann, S., Krueger, A. Zawatzky,
R., Li-Weber, M., Meinl, E.*, Neipel, F.*, Fleckenstein, B.* und
Krammer, P.H. (2002) Viral IFN-regulatory factors inhibit activation
induced cell death via two positive regulatory IRF-regulatory
factore1-dependent domains in the CD95 ligand promoter. J.
Immunol. 168(3):1226-1234.
[3] Klehr, M., Nickolaus, P. und Zawatzky, R. (2003) Molecular
cloning of the mouse IFRG28 gene and functional characterization
of its promoter. Immunobiology 208(1-3): 109. Abstract 34th Annual Meeting of the German Society of Immunology
Etablierung effizienter Herpesvirus-Vektoren
zur Gen- und Immuntherapie
K.-W. Knopf, E. Kehm, S. Schenck
In Zusammenarbeit mit L. Gissmann, M. Müller, H.-W. Zentgraf,
DKFZ; A. Epstein, Universität Lyon, Frankreich; R. Manservigi, P.
Marconi, Universität Ferrara, Italien; T. Brocker, Universität
München, und J. Rajcani, Slowakische Akademie der
Wissenschaften, Bratislava, Slowakei.
Bis Ende Juli 2003 partizipierte das Labor an dem von der
EU geförderten EUROAMP-Projekt, dessen Ziel es ist, neue
und sichere Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1) Vektoren für
die humane Gen- und Immuntherapie zu etablieren und zu
evaluieren.
Unser Labor hat sich dabei näher mit den Einsatzmöglichkeiten
von HSV-1 Amplicon-Vektoren befasst. Die Amplicon-
Vektoren sind aufgrund ihres breiten Wirtsspektrums, ihrer
großen Transgenkapazität, der hohen Toleranz des natürlichen
Wirts Mensch und der möglichen Anwendung im Zentralen
Nervensystem vielversprechende Kandidaten für die
Gentherapie. Der Amplicon-Vektor wird durch Replikation
und Verpackung von Transgen-enthaltenden Amplicon-Plasmiden
erzeugt und weist eine dem infektiösen HSV-1 Partikel
identische Morphologie auf. Zwei alternative, für die
Amplicon-Verpackung benötigte Helfersysteme wurden im
Detail analysiert, u. zw. (i) das HSV-1 LaL- und (ii) das HSV-1
BAC(Bakterielles Artifizielles Chromosom)-System. Zur Beurteilung
und Verbesserung dieser bisher bekannten Verpackungsmöglichkeiten
wurde eine vergleichende Analyse der
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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