MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt B
Funktionelle und Strukturelle Genomforschung
zehntausend Gene und somit weite Bereiche der Gene
des menschlichen und murinen Genoms umfassend repräsentieren.
Um hiervon entsprechende DNA-Microarrays
herstellen zu können, mussten die etablierten bisherigen
Protokolle weiterentwickelt werden. Durch umfassende
methodische Optimierungsarbeiten, die u.a. die Art der
verwendeten Glasoberfläche, Spotting-Pufferrezeptur, Minimierung
der Hintergrund-Fluoreszenz und erzielbare Spot-
Dichte umfassten, konnte ein Protokoll entwickelt werden,
welches die Aufbringung von bis zu 70.000 genspezifischen
Sonden auf einer Glasoberfläche ermöglicht [37].
Ein weiteres gravierendes Problem bei der Analyse von
Tumortranskriptomen besteht in der oftmals limitierten
Menge an RNA-Ausgangsmaterial, die die Analyse stark
beeinträchtigt oder gar verhindert. Deshalb haben wir ein
neuartiges in-vitro-mRNA-Amplifikationsprotokoll entwickelt,
welches es gestattet, selbst von geringen Nanogramm-
Mengen Gesamt-RNA ausgehend, ausreichend aRNA zu
generieren, um hiermit zuverlässig und erfolgreich Expression-Profiling-Experimente
auf Oligonukleotid-Microarrays
durchführen zu können. Bisherige RNA-Amplifikationsprotokolle
waren mit gespotteten Oligonukleotid-
Microarrays, die üblicherweise sense-orientierte
Oligonukleotid-Sonden tragen, nicht kompatibel, da diese
Verfahren ebenfalls einen markierten sense-cDNA-Strang
produzieren. Dies neuartige Protokoll ergibt Dye-markierte
antisense-cDNA, die mit den üblichen Typen gespotteter
Oligonukleotid-Microarrays voll kompatibel ist, so dass diese
Amplifikationstechnik einen wichtigen technologischen
Fortschritt auf diesem Gebiet darstellt. Das Verfahren wurde
seitdem in einer Vielzahl von Projekten sehr erfolgreich
angewendet.
Einen methodisch äußerst wichtigen Aspekt im Zusammenhang
mit Microarray-Experimenten stellt die finale Analyse
und Interpretation der gewonnen enormen Datenmengen
dar. Die Datenanalyse erfolgt über komplexe Computerverfahren,
die unterschiedliche Methoden der Bioinformatik,
Biostatistik und des Data Mining vereinen. Benötigt werden
des Weiteren spezifische Datenbanken, die alle grundlegenden
Informationen zu den auf die Microarrays aufgebrachten
genspezifischen Sonden (z.B. Klon- und Geninformationen)
erfassen und speichern. Dies erfolgt in unserer
selbst entwickelten “clone database”, die u.a. Links
zu den bedeutenden biologischen Datenbanken, Informationen
über Genlokalisation, funktionelle Annotation etc.
umfasst und sich automatisch selbst aktualisiert. Alle relevanten
Schritte der high-throughput-Experimente sowie
des Microarray-Produktionsprozesses werden zudem in
unserem selbst entwickelten Laboratory Information and
Management System “QuickLIMS” [42] erfasst und dokumentiert.
Als Kernkomponente der Datenspeicherung und
der statistischen Analyse der Microarray-Experimente, entsprechend
der MIAME-Standards, wurde ferner das Programmpaket
“ChipYard framework” entwickelt, welches es
dem Microarray-Anwender ermöglichen soll, seine experimentellen
Ergebnisse unter definierten Bedingungen auswerten
zu können.
Die beschriebenen methodischen Entwicklungen waren die
Voraussetzung für die erfolgreiche Herstellung und Anwendung
eines neuen Microarray-Typs, der für 27.000 humane
Gene spezifische 70mer Oligonukleotide jeweils als Replikat
trägt (d.h. insgesamt 54.000 Spots je Microarray). Dieser
70mer-Microarry wurde im Rahmen verschiedener Studien
an epithelialen, hämatologischen und cranialen Tumorserien
Abteilung B060
Molekulare Genetik
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
sowie Zellkultur-Modellen von Apoptose bis Organabstoßung
mit großem Erfolg eingesetzt, so u.a.:
• Basaliome: Expression-Profiling-Studien an einer Serie
von Basaliomen und nachfolgende bioinformatische Analysen
der identifizierten, im Vergleich zu normaler Haut
differentiell exprimierten Gene zeigten, dass in diesen
Tumoren insbesondere Gene des Zellzyklus, der Meiose
und von DNA-Replikation/ Chromosomal Cycling hochreguliert
sind. Durch Vergleich mit Daten aus Expression-Profiling-Studien
am Tumorprogressionsmodell der
murinen Haut nach DMBA/TPA-Behandlung wurden
wichtige gemeinsame Kandidatengene und Pathways
identifiziert, die für die humane epidermale
Karzinogenese relevant sind und derzeit molekular eingehend
weiter charakterisiert werden [43].
• Studien zur molekularen Wirkung eines neuartigen
Immunsuppressivums und Proliferationshemmers im Zellkulturversuch.
• Studien an primären Mammatumoren zur Identifizierung
prognostisch relevanter Gensignaturen.
Weiterhin wurden zwei umfassende DNA-Microarray-Typen
für die Analyse muriner Expressionsprofile hergestellt, die
20.000 (LION-Microarray) bzw. 23.000 (NIA-Microarray) verschiedene
genspezifische Sequenzen der Maus repräsentieren.
Hierdurch kann nun auch das für die Tumorforschung
äußerst wichtige Tiermodell “Maus” mittels dieser Technik
erschlossen werden. In einer in Zusammenarbeit mit der
Abteilung von P. Angel durchgeführten Studie zur Tumorprogression
konnten zahlreiche Gene identifiziert werden,
die in der Maus an der mehrstufigen Entstehung von Hauttumoren
unter Einfluss des Tumorpromoters TPA beteiligt
sind. Diese Ergebnisse wurden durch quantitative real-time-
PCR bestätigt. Erste auf diesen Ergebnissen basierende
Folgestudien an humanen Tumoren belegen bereits, dass
einige der so identifizierten Gene auch an der Entstehung
menschlicher Hauttumoren beteiligt sind.
Gewebe Mikroarrays
In Zusammenarbeit mit Harald Stein (Benjamin-Franklin-Hospital,
Berlin), Bernd Dörken (Charite, Berlin), Guido Sauter (Pathologisches
Institut der Universität Basel), Andrey Korshunov
(Burdenko Institut, Moskau), Hermann-Joseph Gröne (DKFZ)
Gewebe Mikroarrays (DNAs) sind geeignet für Hochdurchsatzuntersuchungen
immunhistochemischer und zytogenetischer
Parameter von klinisch definiertem Tumormaterial.
Kandidatengene und Proteine können mit Hilfe von TMAs
schnell auf Zusammenhänge mit klinischen Parametern wie
der Bildung von Metastasen oder dem Gesamtüberleben
hin getestet werden. Wir haben TMAs aus mehr als 5500
verschiedenen Tumoren von 2700 unterschiedlichen Patienten
hergestellt. Darin sind enthalten: Tumoren der Kopf-
Hals-Region, Prostatakarzinome, Basaliome, Hodgkin Lymphome,
niedrig und hochmaligne B-Zell Lymphome, T-Zell
Lymphome, Meningiome, Medulloblastome, Thymome sowie
adenoid-zystische Karzinome. Die Protokolle für die Fluoreszenz
in situ Hybridisierung an TMAs wurden weiter optimiert,
sodass Untersuchungen auf TMAs mit BAC und PAC
Sonden jeder beliebigen genomischen Region durchgeführt
werden können [19]. Darüber hinaus führten wir eine neue
Strategie zur automatischen Daten-Aufnahme und Evaluation
immunhistochemischer Analysen ein. Diese basiert auf
der Erfassung digitaler Bilder mittels Laser Scanninng Verfahren
[26]. Beide der genannten Applikationen sind von
hohem praktischen Wert und wurden für eine Anzahl von