MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt B
Funktionelle und Strukturelle Genomforschung
Arbeitsgruppe Chipbasierte Peptidbibliotheken (B120)
Leiter: Dr. Volker Stadler
Wissenschaftliche Mitarbeiter
Dipl.-Chem. Mario Beyer
Dr. Simon Fernandez
Dipl.-Phys. Kai König
Doktoranden
Thorsten Kühlwein
Tim Seeberg
Herstellung hochkomplexer Peptidarrays
V. Stadler, F. Breitling, R. Bischoff
Die Arbeiten finden in enger Kooperation mit PD Dr. Frank
Breitling (Mitarbeiter: Dr. Thomas Felgenhauser, Dipl.-Biol.
Sandra Lüttgau) aus der Abteilung „Molekulare Genomanalyse“
sowie mit PD Dr. Ralf Bischoff (Mitarbeiter: Dipl.-Phys.
Alexander Nesterov, Dipl.-Ing. Klaus Leibe) aus der Abteilung
„Molekulare Biologie der Mitose“ statt. In einer Zusammenarbeit
mit PD Dr. Michael Himmelhaus und PD Dr. Reiner
Dahint von der Angewandten Physikalischen Chemie der
Universität Heidelberg wird zudem an der Entwicklung eines
markierungsfreien Nachweisverfahrens von
biospezifischen Bindungsereignissen gearbeitet.
Im Unterschied zu Oligonukleotidarrays, die für die Untersuchung
des DNA- und RNA-Status eingesetzt werden und
damit Rückschlüsse auf unterschiedlich starke Genexpression
von Zellen erlauben, zielen Peptidarrays auf den Nachweis
von Proteinen und Antikörpern und somit auf die Abbildung
des „Ist-Zustands“ eines Organismus ab. Da der „Ist-Zustand“
jedoch nicht ausschließlich durch die Genexpression
bestimmt wird, sollten Peptidarrays einen wesentlich direkteren
Zugriff auf charakteristische Signalmuster bieten, die
z.B. mit einem pathogenen Status einhergehen. Mit den
verfügbaren Methoden für die kombinatorische Synthese
von Arrays konnten jedoch aufgrund konzeptioneller Nachteile
wie die Diffusion von Monomeren bei elektrolytischen
Verfahren [Southern et al., US Patent 5667667, 1997;
Heller et al., US Patent 5929208, 1999], eine zu hohe
Anzahl der notwendigen Kopplungszyklen in der lithographische
Synthese [Fodor et al., Science, 251 (1991), 767-
773; Pellois et al., Nat. Biotech., 20 (2002), 922-926] oder
die sehr problematische Handhabung von Flüssigkeiten im
Nano- bis Picoliterbereich beim Tintenstrahldruck und der
SPOT-Synthese [Frank, Tetrahedron, 48 (1992), 9217-9232;
Frank, J. Biotechnol., 41 (1995), 259-272; Kramer et al.,
Methods, 6 (1994), 388-395] bislang keine Peptidarrays
mit mehr als 150 Peptidspots pro cm2 hergestellt werden.
In der Arbeitsgruppe soll ein Verfahren entwickelt werden,
das die oben beschriebenen Nachteile umgeht und die
Herstellung von Peptidarrays mit Komplexitäten von
> 375 cm-2 mit Hilfe eines speziellen Laserdruckers bzw.
von > 40.000 cm-2 mit Hilfe eines CMOS Chips ermöglichen
soll. Den Kernpunkt des Verfahrens stellen elektrostatisch
aufladbare Monomerpartikel dar, die die Bausteine für die
kombinatorische Peptidsynthese in Form von aktivierten
Fmoc-Aminosäuren enthalten [1]. Die Partikel bestehen
im Wesentlichen aus einem Matrixmaterial (z.B. Diphenylsulfoxid),
das bei Raumtemperatur fest ist und bei Temperaturen
von 65-95°C schmilzt, wobei es dann die Monomere
freisetzt und als Lösungsmittel für die kombinatorischen
Synthese dient (Abb. 1). Weitere Additive sind so genannte
CCAs (charge control agents), CS (charge stabilizer) und
B120
Chipbasierte Peptidbibliotheken
Abb. 1: Prinzip der Monomerpartikel
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
Antibackmittel (z.B. Silicapartikel, Aerosile), die eine kontrollierte,
triboelektrische Aufladung gewährleisten bzw.
eine Agglomeration der mikrometergroßen Monomerpartikel
verhindern [2]. Die Partikelherstellung erfolgt durch Mahlen
einer glasartigen Schmelze mit einer Luftstrahlmühle bzw.
mit Hilfe des RESS-Verfahrens (rapid expansion of supercritical
solutions [Matson et al., Ind. Eng. Chem. Res.,26
{1987}, 2298-2306]) durch Abscheidung aus überkritischem
CO . Mit beiden Methoden konnten bereits Mono-
2
merpartikel mit einer engen Größenverteilung unterhalb
von 10 µm hergestellt werden. Grundsätzlich erlaubt die
Trennung von Partikelherstellung, Adressierung und chemischer
Kopplung eine einfachere Handhabung und Reaktionskontrolle
im Vergleich zu den oben aufgeführten alternativen
Methoden.
Die Adressierung der Monomerpartikel auf einen Träger erfolgt
durch elektrostatische Wechselwirkung zwischen den
elektrisch geladenen Partikeln und einem Ladungsmuster
auf einem Träger. Das Ladungsmuster wird entweder durch
die LED-Zeilen eines Laserdruckers und die daraus folgende
strukturierte Belichtung einer vorgeladenen Photowalze
oder aber durch ein Array von Pixelelektroden auf einem
CMOS Chip [3] generiert. Entsprechend erfolgt die Aufladung
der Partikel in einer Tonerkartusche (Laserdrucker)
oder in einem Partikelaerosol (CMOS Chips). Mit dem Laserdrucker
konnten bereits Aminosäurespots in einer Auflösung
von bis zu 736 cm-2 gedruckt werden (Abb. 2), während
beim CMOS Chip zunächst Simulationen der elektrostatischen
Felder Aufschluss über das zu wählende Chipdesign
geben sollen.
Die Herstellung von Peptidarrays soll letztendlich dadurch
ermöglicht werden, dass zunächst eine erste Schicht aller
verschiedenen Monomerpartikel nacheinander auf dem Träger
ortsaufgelöst abgelegt wird. Die Kopplungsreaktion wird
nun gleichzeitig durch definiertes Schmelzen der Partikel
ermöglicht, wobei nach routinemäßigen Syntheseschritten
nach Merrifield eine erste Schicht aller verschiedenen Aminosäuren
an den Träger angebunden wird. Darauf kann wiederum
ortsaufgelöst eine zweite, dritte usw. Schicht aller
verschiedenen Monomerpartikel adressiert werden, bis
schließlich die vollständige Peptidbibliothek z.B. in Form von