MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt B
Funktionelle und Strukturelle Genomforschung
Methodenentwicklung und Anwendung der
Massenspektrometrie in der Krebsforschung
(Ktr 12472)
W.D. Lehmann, A. Schlosser, M. Wind, M. Salek,
J. Wei, G. Erben
In Zusammenarbeit mit: D. Bossemeyer, D. Kübler, V. Kinzel, A.
Eisenmenger, H. Wesch, A. Alonso, M. Eisenhut, I. Grummt, R.
Pipkorn (DKFZ). J. B. Helms, F. Wieland, Biochemiezentrum,
Universität Heidelberg; D. Manstein, MPI f. Medizinische
Forschung, Heidelberg; N. Jakubowski, Inst. f. Angewandte
Spektroskopie (ISAS), Dortmund; E. Nigg, MPI für Biochemie,
Martinsried; R. Kellner, Merck AG, Darmstadt.
Zusatzfinanzierung: BMBF (W.D. Lehmann) Application of laserablation
ICP-MS for the analysis of protein phosphorylation
coupled with metabolome analysis of Corynebacterium
glutamicum TP6, 1 postdoc und Geräte (6/02 - 5/05).
Analytik von kovalenten Proteinmodifikationen
mit Massenspektrometrie
Die kovalente Modifikation von Proteinen und die darauf
aufbauende nichtkovalente Wechselwirkung von Proteinen
sind die zentralen Phänomene der physiologischen und pathophysiologischen
zellulären Regulation. Die Massenspektrometrie,
darunter besonders die hochauflösende Tandem-
Massenspektrometrie hat sich zur zentralen Analysentechnologie
für kovalente Proteinmodifikationen entwickelt.
Dabei stehen zur Zeit die Bestimmung der Modifikationsart
und die Identifizierung der Modifikationsstelle im Mittelpunkt
der analytischen Möglichkeiten. Wir arbeiten an der methodischen
Weiterentwicklung der Analytik von kovalenten
Proteinmodifikationen mit dem Schwerpunkt Proteinphosphorylierung
an Serin, Threonin und Tyrosin.
Fragmentierungsregeln, Proteinidentifizierung,
Myristoylierung, Acetylierung
Wir haben eine neue Fragmentierungsart von mehrfach
geladenen Peptidionen beschrieben, die N- oder C-terminale
Sequenzleitern erzeugt und damit auch die Erkennung
von Peptid-Modifikationen unterstützt [1]. Mit Tandem
Massenspektrometrie und Präzisionsmassenanalytik von Dipeptid-
und Tripeptid-Fragmentionen haben wir eine neue
Proteinidentifizierungsstrategie entwickelt, bei der die gemessene
Präzisionsmasse direkt in eine minimale Sequenzinformationen
umgesetzt wird. Aus mehreren solcher kurzen
Sequenzen lässt sich das Ausgangsprotein in einer Datenbank
identifizieren (Patchwork Sequencing) [2]. Wir haben
an Proteinen eine N-terminale Myristoylierung [3] sowie
eine N-terminale Acetylierung [4] beschrieben.
Proteinphosphorylierung
Es wurden zwei verbesserte Strategien für die Analyse der
Proteinphosphorylierung eingeführt. Eine beruht auf dem
Einsatz einer unspezifischen Protease (Elastase) zur Erzeugung
von relativ kleinen Peptiden, bei denen sich die Phosphorylierung
besser erfassen lässt als bei großen Peptiden
[5], die andere beruht auf der gezielten Suche mit vorberechneten
Phosphopeptid-Kandidaten Massen [6]. Durch
beide Verfahren wird die Nachweisempfindlichkeit verbessert.
Die Kombination Kapillar-Chromatographie/Element-Massenspektrometrie
mit Phosphor-Detektion wurde zur Analytik
der Proteinphosphorylierung weiter methodisch verbessert
[7]. Dabei wurden durch Kombination von Element-Massenspektrometrie
und Electrospray Tandem-Massenspektrometrie
auch unbekannte Protein-Phosphorylierungsstellen
charakterisiert [8-10]. Die Element-Massenspektrometrie
wurde auch zum direkten Nachweis von Phosphoproteinen
B090
Zentrale Spektroskopie
von Blot-Membranen erprobt [11] sowie zur Proteinquantifizierung
über Messung von Schwefel eingesetzt [12].
Aktuelle Anwendungen der Element-Massenspektrometrie
in den Biowissenschaften wurden in einem Übersichtsartikel
zusammenfassend beschrieben [13].
Publikationen (* = externer Koautor)
[1] Salek M, Lehmann WD. Neutral loss of amino acid residues
from protonated peptides in collision-induced dissociation generates
N- or C-terminal sequence ladders. J Mass Spectrom 38
(2003) 1143-1149.
[2] Schlosser A, Lehmann WD. Patchwork peptide sequencing –
extraction of sequence information from accurate mass data of
peptide tandem mass spectra recorded at high resolution.
Proteomics 2 (2002) 524-533.
[3] *Eberle HB, *Serrano RL, *Füllekrug J, Schlosser A, Lehmann
WD, *Lottspeich F, *Kaloyanova D, *Wieland FT, *Helms JB.
Identification and characterization of a novel human plant pathogenesis-related
protein that localizes to lipid-enriched
microdomains in the Golgi complex. J Cell Sci 115 (2002) 827-838.
[4] Schlosser A, *Klockow B, *Manstein DJ, Lehmann WD. Analysis
of posttranslational modification and characterization of the
domain structure of dynamin A from Dictyostelium discoideum. J
Mass Spectrom 115 (2003) 277-282.
[5] Schlosser A, Bodem J, Bossemeyer D, Grummt I, Lehmann
WD. Identification of protein phosphorylation sites by a
combination of elastase digestion, immobilized metal affinity
chromatography, and quadrupole time-of-flight tandem mass
spectrometry. Proteomics 2 (2002) 911-918.
[6] Salek M, Alonso A, Pipkorn R, Lehmann WD. Analysis of protein
tyrosine phosphorylation by nanoESI high -resolution tandem
mass spectrometry and tyrosine-targeted product ion scanning.
Anal Chem 75 (2003) 2724-2729.
[7] Wind M, Eisenmenger A, Lehmann WD. Modified direct-injection
high-efficiency nebulizer with minimized dead volume for the
analysis of biological samples by micro- and nano-LC-ICP-MS. J
Anal At Spectrom 17 (2002) 21-26.
[8] Wind M, Gosenca D, Kübler D, Lehmann WD. Stable isotope
phospho-profiling of fibrinogen and fetuin subunits by element
mass spectrometry coupled to capillary liquid chromatography.
Anal Biochem 317 (2003) 26-33.
[9] Wind M, *Kelm O, *Nigg EA, Lehmann WD. Identification of
phosphorylation sites in the polo-kinases Plx1 and Plk1 by a
novel strategy based on element and electrospray high- resolution
mass spectrometry. Proteomics 2 (2002) 1516-1523.
[10] *Kelm O, Wind M, Lehmann WD, *Nigg EA. Cell cycle-regulated
phosphorylation of the Xenopus polo-like kinase Plx1. J Biol
Chem 277 (2002) 25247-25256.
[11] Wind M, *Feldmann I, *Jakubowski N, Lehmann WD. Spotting
and quantification of phosphoproteins purified by gel electrophoresis
by laser ablation element mass spectrometry with
phosphorus-31 detection. Electrophoresis 24 (2003) 1276-1280.
[12] Wind M, *Wegener A, Eisenmenger A, *Kellner R, Lehmann
WD. Sulfur as the key element for quantitative protein analysis
by capillary liquid chromatography coupled to element mass spectrometry.
Angew Chem Int Ed Engl 115 (2003) 3425-3427.
[13] Wind M, Lehmann WD. Element and molecular mass spectrometry
- an analytical dream team in the life sciences. J Anal At
Spectrom 19 (2004) 20-25.
Methodische Entwicklung und Anwendung der
Hochfeld-Kernmagnetischen-Resonanz-(MR)-
Spektroskopie und Bildgebung (Ktr 12471)
W.E. Hull, D. Albert, K. Bettinger
In Zusammenarbeit mit: M. Wießler, R. Owen, H. Bartsch, J.
Debus, H. Walczak, R. Pipkorn (DKFZ);
I. Walter-Sack, Innere Medizin VI, Klinische Pharmakologie und
Pharmakoepidemiologie, Universitätsklinikum Heidelberg; Y.J.L.
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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