MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt E
Innovative Krebsdiagnostik und -therapie
beide Aristolochiasäuren genotoxische Mutagene. Die
Addukt-Bildung erfolgt erst nach metabolischer Aktivierung
von AA durch einfache Reduktion der Nitrogruppe und
führt zu mehreren Produkten [1]. Das von AA in vivo hauptsächlich
gebildete DNA-Addukt ist ein persistentes
Desoxyadenosin-Addukt (dA-AAI), welches noch nach Jahren
in der DNA von CHN-Patienten detektierbar ist. Sowohl
mikrosomale als auch cytosolische Säuger-Enzyme,
die in der Lage sind diese reduktive Aktivierung zu
katalysieren, konnten bisher identifiziert werden
(Prostaglandin H Synthase, Xanthin Oxidase, DT-Diaphorase,
Peroxidasen, NADPH:P450 Reduktase und die Cytochrome
P450 1A1 und 1A2) [1] [Stiborová et al., Chem. Res.
Toxicol. 14 (2001) 1128-1137]. Verwendet man humane
Leber-Mikrosomen als metabolisches System, so sind im
wesentlichen die Cytochrome P450 1A1 und 1A2 für die
Aktivierung von AAI und AAII verantwortlich. Metabolismus-
Studien zur Beeinflussung der AA-spezifischen DNA-
Adduktbildung durch spezifische Enzym-Inhibitoren bzw.
Induktoren und Cofaktoren mit cytosolischen Fraktionen
von Ratten-Lebern und Ratten-Nieren ergaben, dass vorallem
die DT-Diaphorase (NAD(P)H:Chinon Oxidoreduktase)
für die cytosolische Aktivierung von AA verantwortlich ist
[4]. Analoge Studien mit humanem Cytosol von Leber und
Niere bestätigten, daß die AA aktivierende Aktivität hauptsächlich
von der DT-Diaphorase ausgeht, aber auch eine
Beteiligung der Xanthin Oxidase nicht ausgeschlossen werden
kann [5]. Alle cytosolischen Fraktionen, sowohl von
der Ratte als auch vom Mensch waren in der Lage AA
metabolisch zu aktivieren und führten zur Bildung von DNA-
Addukten, deren Analyse mit dem ³²P-postlabeling Verfahren
AA-spezifische Adduktmuster, wie man sie von AAexponierten
Personen (CHN-Patienten) kennt, mit dem
Desoxyadenosin-Addukt (dA-AAI) als Hauptaddukt, ergaben.
Die Identifizierung humaner Enzyme, welche an der Aktivierung
von AA beteiligt sind, bildet die Grundlage für
weitere Studien zur Bestimmung der individuellen Empfindlichkeit
des Menschen gegenüber der krebsauslösenden
Wirkung von AA.
Eine neue Wirkungsweise des
Tumortherapeutikums Ellipticin
E. Frei, M. Stiborová, C.A. Bieler, A. Breuer,
L. Borek-Dohalská
In Zusammenarbeit mit dem Fachbereich Biochemie der Naturwissenschaftlichen
Fakultät der Karls Universität Prag (Leitung Prof.
Dr. M. Stiborová).
Ellipticin ist ein Pflanzeninhaltsstoff mit guter tumortherapeutischer
Aktivität, gegen Brustkrebsmetastasen, Nierensarcome
und Hirntumoren. Ellipticin ist auch aktiv gegen
HIV. Die zelluläre Wirkung von Ellipticin ist sehr weit gefächert,
bisher wurden Angriffspunkte an der DNA
(Interkalierung und Topoisomerase II Hemmung) an regulatorischen
Proteinen (p53) und an Mitochondrien (Entkopplung
der Atmungskette) beobachtet (siehe [Stiborová
M. et al. Biochem. Pharmacol. 62 (2001) 1675]). In einer
lange währenden Kooperation zwischen der Abteilung
Molekulare Toxikologie und dem Fachbereich Biochemie der
Karls Universität Prag wurde ein weiterer Wirkmechanismus
für Ellipticin entdeckt und weitgehend charakterisiert.
Ein Zufallsbefund zeigte, dass Ellipticin sich nicht nur in die
DNA einlagert, sondern dort auch kovalent bindet und
mindestens zwei spezifische DNA-Addukte bildet, die durch
Abteilung E080
Molekulare Toxikologie
die ³²P-postlabeling Methode gefunden wurden. Wie für
viele andere Fremdstoffe ist für diese DNA-Adduktbildung
eine enzymatische Aktivierung nötig. Dass Ellipticin im Körper
verstoffwechselt wird, war aus Untersuchungen des
Urins von Menschen, die mit Ellipticin behandelt wurden,
bekannt, dort tauchte 9-Hydroxy-Ellipticin als Hauptmetabolit
auf (siehe Schema). Aromatische Verbindungen
derartiger Struktur, werden fast immer durch Cytochrom
P450 Enzyme (CYP) oxidiert, damit sie wasserlöslich und
ausgeschieden werden können. Die Familie der CYP kommt
hauptsächlich in der Leber, aber auch in anderen Organen
vor. Die Untersuchung von Lebermikrosomen-Fraktionen
verschiedener Spezies auf ihre Fähigkeit hin, Ellipticin zu
aktivieren und DNA-Addukte zu bilden, ergab, dass
Kaninchenlebern sehr aktiv waren, gefolgt von Rattenlebern,
und Lebern aus Zwergschweinen, die ähnlich denen
aus Menschen waren [Stiborová M. et al. Biochem.
Pharmacol. 62 (2001) 1675]. Mit verschiedenen Methoden
wurde nun versucht, die für die Aktivierung von Ellipticin
verantwortlichen CYP zu identifizieren. Da bekannt ist, dass
z.B. Brusttumoren eine andere CYP Ausstattung haben als
normales Brustgewebe, postulierten wir, dass eine tumorspezifische
Aktivierung von Ellipticin erfolgen könnte.
CYP lassen sich in Versuchstieren mit verschiedenen Substanzen
induzieren und hemmen. Menschliche CYP sind
gentechnisch in Insektenzellen exprimiert zu erwerben. Mit
diesen Methoden war es möglich zu zeigen, dass in Menschen
und Ratten die gleichen zwei CYP Isoenzyme für die
Aktivierung von Ellipticin verantwortlich sind, CYP 3A4 bzw.
3A1 und CYP 1A1/2. In Kaninchen hingegen ist eine ganz
andere CYP Spezies aktiv. Ratten bieten sich daher als ideale
Modelle an, um die Wirkung von Ellipticin zu untersuchen
und Rückschlüsse auf den Menschen ziehen zu können.
Diese CYP Enzyme sind in Brusttumoren und Nierenzellcarcinomen
erhöht, sodass damit unser Postulat einer
„tumorspezifischen“ Ellipticin Aktivierung einen Stützpfeiler
erhalten hat. [6]. Ellipticin selbst induziert zudem CYP
1A1/2 in der Leber, und somit dort seinen eigenen Stoffwechsel
[7].
Ratten wurden mit Ellipticin behandelt und die DNA Addukte
in verschiedenen Organen untersucht. In den Organen
wurden die gleichen zwei Addukte gefunden, die auch
mit isolierten Leberfraktionen und zugesetzter DNA beobachtet
wurden, zusätzlich aber noch drei weitere Addukte.
Wie erwartet wurden in der Leber die meisten Addukte
gemessen, gefolgt von der Milz, der Lunge, dem Herzen
und dem Hirn. Keine Addukte wurden in den Hoden dieser
Ratten gefunden [8,9]. Inzwischen ist es uns gelungen,
in einem gesunden Brustgewebe und in einem Brusttumor
von weiblichen Ratten die typischen Ellipticin-DNA-
Addukte nachzuweisen.
Als Bindeglied zwischen isolierten Leberfraktionen aus
Mensch und Tier und dem Gesamtorganismus Tier werden
Hamsterzellen verwendet, die durch Transfektion menschliche
CYP Enzyme exprimieren. In Versuchen mit solchen
Zellen hat sich gezeigt, dass auch hier die gleichen
Isoenzyme für die Aktivierung zu DNA bindenden Spezies
verantwortlich sind. Das Adduktmuster in den Zellen glich
dem in Tieren. Die Versuche zeigten allerdings, dass die
Giftigkeit von Ellipticin für diese Zellen nicht abhängig von
der enzymatischen Ausstattung dieser gentechnisch transformierten
Zellen war. Alle Zelllinien waren gleich empfindlich,
die Hälfte der Zellen starb nach 48h in Gegenwart von
0,25 - 0,4mM Ellipticin [10]. Im Moment laufen Untersuchungen
an menschlichen Tumorzelllinien verschiedenen
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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