MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt B
Funktionelle und Strukturelle Genomforschung
In Kooperation mit K. Zatloukal, Karl Franzens Universität, Graz,
Österreich
Stress, besonders oxidativer Stress führt bei Zellen zu Fehlern
bei der Proteinfaltung, und bei ausbleibender Neufaltung
oder ausbleibendem Abbau zur Ausbildung von cytoplasmatischen
Aggregaten. Proteinaggregate sind charakteristisch
für verschiedene chronisch toxische und degenerative
Erkrankungen wie Mallory bodies bei alkoholischer und
nicht-alkoholischer Steatohepatitis, neurofibrilläre Ablagerungen
bei Alzheimer und Lewy bodies bei Parkinson. Durch
2D-Gelelektrophorese und Massenspektrometrie konnte
p62, neben HSP70, HSP25 und ubiquitinylierten Cytokeratinen
, als neue Komponente in Mallory bodies identifiziert
werden. [7]
Modifikation von Proteinen
In Kooperation mit C. Mandal, Indian Institute of Chemical Biology,
Kolkata, Indien
Humanes C-reaktives Protein (CRP) besitzt klinische Relevanz
bei der Diagnose . Verschiedene krankheitsspezifische CRPs
zeigen unterschiedliche Molekulargewichte in der Gelelektrophorese.
Es konnte gezeigt werden, dass CRP unter
bestimmten pathologischen Bedingungen glykosyliert wird.
[10]
In Kooperation mit J. Kuhn, Herz- und Diabeteszentrum
Nordrhein-Westfalen, Bad Oeynhausen
Humane Xylosyltransferase transferiert Xylose von UDP-Xylose
auf Proteoglykan Proteine. Rekombinante His-getaggte
Xylosyltransferase konnte in löslicher Form in hoher Ausbeute
in Insektenzellen exprimiert werden. Das gereinigte, biologisch
aktive Protein konnte zur Homogenität gereinigt werden.
Der Peptidmassenfingerprint zeigte das erwartete
Spektrum. Durch N-terminale Sequenzierung konnte ge-
B100
Zentrale Proteinanalytik
zeigt werden, dass die Signalsequenz des exprimierten Proteins
quantitativ abgespalten wird. [15]
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
In Kooperation mit M. Ott, University of California, San Francisco,
USA
Das HIV-1 Transaktivatorprotein Tat reguliert die
transkriptionelle Aktivität des integrierten HIV-1 Provirus.
Dazu bindet Tat an eine charakteristische RNA Struktur am
5’ Ende aller HIV-1 Transkripte und erhöht die Elongationseffizienz
der RNA Polymerase II durch Rekrutierung des
essentiellen pTEFb-Elongationskomplexes zum Promotor.
Zusätzlich interagiert Tat mit zellulären Cofaktoren, darunter
die Acetyltransferasen p300/CBP und pCAF, und wird
selbst durch p300/CBP an Lysin 50 acetyliert. Die K50-
Acetylierung ist notwendig für die transaktivierende Wirkung
von Tat auf die HIV-1 Transkription.
Mit Hilfe von MALDI TOF MS, proteolytischer Spaltung und
Edman Sequenzanalyse wurde auf Peptid- und erstmals
auch auf Proteinebene bestätigt, dass K50 die einzige
Acetylierungsstelle von p300/CBP in Tat ist. Durch Analyse
von Tat Mutantenpeptiden in Kombination mit transienten
Transfektionsstudien von 1G5 Zellen und statistischer Auswertung
von p300/CBP Substratproteinsequenzen konnten
die für die Lysinacetylierung durch p300/CBP kritischen
Aminosäurereste charakterisiert und zu potentiellen
Substratsequenzen kombiniert werden. Datenbanksuchen
mit diesen Sequenzen führten zur Identifizierung neuer
Substrate von p300/CBP. Zusätzlich wurde gezeigt, dass
K50 in Tat auch von pCAF acetyliert wird, und dass
Cysteinreste unabhängig von der umgebenden
Peptidsequenz als enzymunabhängige Acetylgruppenakzeptoren
fungieren können. Die Vernachlässigung der
nichtenzymatischen Cysteinacetylierung kann zur fehlerhaften
Interpretation von Acetylierungsstudien führen [11].
Abbildung: MALDI TOF MS Spektrum eines HIV-1 Tat Peptids (MW 1326 Da) nach in vitro Acetylierung. Die einfache Lysinacetylierung
bewirkt eine Massenverschiebung von + 42 Da.